張燕　周琳　唱?jiǎng)P　陳敏　鄧少麗　陳鳴

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科， 重慶 400042)

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結(jié)核感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞NLRP3的表達(dá)研究*

張燕周琳唱?jiǎng)P陳敏鄧少麗陳鳴

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科， 重慶 400042)

目的檢測(cè)NLRP3 mRNA在潛伏期、活動(dòng)期結(jié)核患者及健康者中的表達(dá)差異，探討NLRP3在結(jié)核感染中的作用。方法選取10例活動(dòng)期結(jié)核患者(活動(dòng)期結(jié)核組)，20例潛伏期結(jié)核患者(潛伏期結(jié)核組)，20例健康體檢者(正常對(duì)照組)作為研究對(duì)象，利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)各組研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)水平，并比較各組間的差異。結(jié)果活動(dòng)期結(jié)核組NLRP3 mRNA表達(dá)量是正常對(duì)照組的3.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；潛伏期結(jié)核組NLRP3 mRNA表達(dá)量是正常對(duì)照組的1.60倍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論NLRP3可能參與了結(jié)核活動(dòng)期的炎癥反應(yīng)過程，為進(jìn)一步研究其在抗結(jié)核感染中的作用打下了基礎(chǔ)。

結(jié)核?。?外周血單個(gè)核細(xì)胞； NLRP3

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所致的疾病，是全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一，而我國是結(jié)核病最嚴(yán)重的國家之一，結(jié)核病的控制一直以來備受關(guān)注。巨噬細(xì)胞是人體固有免疫應(yīng)答中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌最重要的細(xì)胞類型，巨噬細(xì)胞表面或胞漿內(nèi)的模式識(shí)別受體通過識(shí)別細(xì)菌的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)(DAMPs)發(fā)揮殺菌效應(yīng)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體[1-2](NLRs)是胞漿內(nèi)重要的模式識(shí)別受體，能感知胞內(nèi)病原微生物產(chǎn)物及代謝性應(yīng)激，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥復(fù)合體的組裝。NLRP3作為NLRs 家族中的一員，它主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，NLRP3蛋白分子與ASC分子，pro-Caspase-1及PAMP或DAMP共同構(gòu)成了NLRP3炎癥小體[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)：白色念珠菌、酵母菌、金黃色葡萄球菌、流感病毒等均能通過NLRP3活化Caspase-1，進(jìn)而在炎癥反應(yīng)和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用[6-9]。那么，在機(jī)體的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中，NLRP3是否會(huì)參與其中，本研究通過檢測(cè)結(jié)核感染者與健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞中 NLRP3 mRNA 的表達(dá)水平并比較其差異，探討NLRP3在機(jī)體抗結(jié)核免疫反應(yīng)中的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年7月～2015年5月到本院就診的疑似結(jié)核患者，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)制定的肺結(jié)核診斷和治療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，研究對(duì)象入組情況如下：活動(dòng)期結(jié)核組10例，其中男性4例， 女性6例，平均年齡(53.42±13.27)歲；潛伏期結(jié)核組20例，其中男性12例，女性8例，平均年齡(53.26±11.56)歲。選取同期到本院進(jìn)行體檢的健康體檢者20例為正常對(duì)照組，其中男性9例，女性11例， 平均年齡(53.67±17.88)歲。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)，Veriti定性PCR儀(美國ABI公司)，ND-1000微量核酸蛋白測(cè)定儀(上海在途生物科技公司)， Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液和RPMI-1640培養(yǎng)基(天津市灝洋生物制品科技公司)，Trizol(美國Invitrogen 公司)，RT-PCR 試劑盒(美國Promega公司)，引物(北京三博遠(yuǎn)志生物公司)，DEPC水(北京索萊寶科技公司)。

1.2.2試驗(yàn)方法①分離外周血單個(gè)核細(xì)胞與提取RNA，抽取研究對(duì)象新鮮肝素抗凝血5 mL，與5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，加至5 mL Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液表面，2000 rpm/min 離心22 min，用吸管分離出單個(gè)核細(xì)胞，并用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌，1800 rpm/min離心7 min，棄上清，單個(gè)核細(xì)胞留于管底。再加Trizol溶液破裂細(xì)胞，利用氯仿、異丙醇、75%乙醇萃取、沉淀的原理提取RNA，并用DEPC水溶解RNA，將提好的RNA通過ND-1000微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度與純度。②RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照RT-PCR反應(yīng)盒的說明書配置逆轉(zhuǎn)錄體系PCR混合液，所提取的樣品RNA點(diǎn)樣2 μL，37℃孵育60 min得到cDNA。-20℃?zhèn)溆?。③熒光定量PCR檢測(cè)，將②步驟所得的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物設(shè)計(jì)如下：NLRP3上游引物5′-CGTGACTCCCATTAAGATCGAGT-3′，NLRP3下游引物5′-CCCGACAGTGGATATAGAACAGA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物 5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，內(nèi)參GAPDH下游引物5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光定量PCR反應(yīng)的結(jié)果，計(jì)算出活動(dòng)期結(jié)核組、潛伏期結(jié)核組和正常對(duì)照組中各標(biāo)本NLRP3和GAPDH的CT值及差值(△ct=CTNLRP3-CTGAPDH)，并計(jì)算活動(dòng)期結(jié)核組、潛伏期結(jié)核組的△△ct(活動(dòng)期結(jié)核組/潛伏期結(jié)核組△ct-正常對(duì)照組△ct)，利用2-△△ct計(jì)算活動(dòng)期結(jié)核組、潛伏期結(jié)核組和正常對(duì)照組之間NLRP3 mRNA的表達(dá)水平差異。

2　結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共提取RNA樣本50個(gè)，吸光度260/280均在1.8～2.0之間，提示總RNA質(zhì)量較好。NLRP3和GAPDH溶解曲線如圖1、圖2所示，圖中僅見單峰，提示兩者特異性良好。

圖1NLRP3的溶解曲線

Figure 1The melt curve of NLRP3

圖2GAPDH溶解曲線

Figure 2The melt curve of GAPDH

正常對(duì)照組、潛伏期結(jié)核組及活動(dòng)期結(jié)核組NLRP3和GAPDH基因的△ct值均呈正態(tài)分布?；顒?dòng)期結(jié)核組NLRP3相對(duì)于GAPDH的平均△ct 值為(2.83±2.90)；潛伏期結(jié)核組NLRP3相對(duì)于GAPDH的平均△ct 值為(4.04±1.09)；正常對(duì)照組NLRP3相對(duì)于GAPDH的平均△ct 值為(4.72±1.29)。活動(dòng)期結(jié)核組、潛伏期結(jié)核組與對(duì)照組之間的平均△ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利用相對(duì)定量2-△△ct法計(jì)算出活動(dòng)期結(jié)核組NLRP3 mRNA表達(dá)量是正常對(duì)照組的3.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；潛伏期結(jié)核組NLRP3 mRNA表達(dá)量是正常對(duì)照組的1.60倍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　三組患者NLRP3 mRNA相對(duì)定量表達(dá)差異

注：與正常對(duì)照組比較，①P<0.05與潛伏期結(jié)核組比較,②P<0.05

3　討論

NLRP3炎癥小體是目前研究得最多的一種炎癥小體，它不僅能被許多細(xì)菌、病毒等病原體所激活，同時(shí)也能被體內(nèi)自身產(chǎn)生的危險(xiǎn)信號(hào)激活[11-13]。NLRP3作為NLRPs蛋白家族中的一個(gè)典型代表，在無激活物質(zhì)存在時(shí)，其LRR 結(jié)構(gòu)域與NACHT 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制自身的寡聚化而處于無活性狀態(tài)。當(dāng)NLRP3識(shí)別的配體直接或間接地結(jié)合于LRR時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，PYD 與CARD 結(jié)構(gòu)域暴露出來，PYD 與ASC 的PYD 結(jié)合，同時(shí)ASC 的CARD 結(jié)構(gòu)域通過CARD-CARD 嗜同作用招募caspase-1 前體對(duì)其進(jìn)行寡聚化，即完成了炎性體的裝配[14-15]。NLRP3炎性體中的caspase-1能將胞內(nèi)IL-1β的前體在116位天冬氨酸裂解，形成活化的成熟IL-1β分泌到胞外產(chǎn)生各種免疫反應(yīng)[16-17]。

有研究證明，在小鼠肺結(jié)核模型中，NLRP3基因敲除的小鼠肺部IL-1β產(chǎn)生明顯減少，研究還證明巨噬細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活依賴結(jié)核分枝桿菌的ESX-1分泌系統(tǒng)[18]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌ESX-1系統(tǒng)的分泌產(chǎn)物ESAT-6可以激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡，且ESAT-6缺失的變異體不能活化NLRP3炎癥小體引起細(xì)胞的死亡[19]。Welin[20]等研究發(fā)現(xiàn)只有用高感染復(fù)數(shù)的H37Rv型結(jié)核分枝桿菌感染人巨噬細(xì)胞，IL-1β的表達(dá)及細(xì)胞的死亡才會(huì)明顯增加。用Caspase-1及組織蛋白酶B的抑制劑不能抑制細(xì)胞的死亡，提示表達(dá)ESAT-6的結(jié)核分枝桿菌活化NLRP3炎癥小體引起細(xì)胞的死亡，不依賴Caspase-1及組織蛋白酶B，即非凋亡的死亡。

本研究采用熒光定量的方法檢測(cè)了50例研究對(duì)象的外周血單個(gè)核細(xì)胞中NLRP3 mRNA的表達(dá)量，旨在探討其在結(jié)核感染中可能的作用。研究結(jié)果表明，活動(dòng)期結(jié)核患者NLRP3的表達(dá)量較潛伏期結(jié)核患者和正常對(duì)照人群明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示NLRP3參與了結(jié)核感染炎癥反應(yīng)。而潛伏期結(jié)核患者與正常對(duì)照人群之間NLRP3的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。出現(xiàn)這種結(jié)果，分析有以下幾方面原因：①研究中收集的病例數(shù)太少，可能存在一定的抽樣偏倚。②潛伏期結(jié)核患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)輕微，不足以引起NLRP3炎癥小體的顯著改變。③NLRP3炎癥小體的表達(dá)除受結(jié)核的影響外，尚有多種已知或未知疾病可以影響，難以完全排除。

總之，由結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與NLRP3有關(guān)，因?yàn)榫奘杉?xì)胞的壞死是病理反應(yīng)的中心過程，因此，針對(duì)NLRP3的靶向阻斷可能是有效的治療途徑。但阻斷NLRP3炎癥小體的缺點(diǎn)在于會(huì)同時(shí)阻斷其對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗作用。因此，進(jìn)一步確認(rèn)NLRP3在調(diào)節(jié)細(xì)胞壞死中起關(guān)鍵作用，且與其他炎癥活動(dòng)無關(guān)的NLRP3調(diào)節(jié)組分將是下一步研究的方向。

4　結(jié)論

NLRP3在活動(dòng)期結(jié)核組的表達(dá)顯著高于潛伏期結(jié)核組和正常對(duì)照組，而潛伏期結(jié)核組與正常對(duì)照組之間無明顯差異，提示NLRP3可能參與了結(jié)核活動(dòng)期的炎癥反應(yīng)過程，也為進(jìn)一步研究其在抗結(jié)核中的作用提供了臨床資料。

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The expression level of the NLRP3 in periphery blood monocyte from tuberculous patients

ZHANG Yan,ZHOU Lin,CHEN Min, et al

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,TheThirdAffiliatedHospitalofTheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

ObjectiveTo study the expression level of the NLRP3 mRNA in periphery blood monocyte from tuberculous patients, recessive tuberculous patients and normal people, then explore the effect of NLRP3 in tuberculous patients. MethodsBlood samples were respectively collected from 10 tuberculous patients, 20 cases of recessive tuberculous patients and 20 cases of healthy people. The expression level of the NLRP3 mRNA was detected with real time PCR. ResultsThe expression of NLRP3 mRNA in tuberculous patients was significantly higher than in healthy people and recessive tuberculous patients(P<0.05). There is no difference between healthy people and recessive tuberculous patients(P=0.680，P>0.05). ConclusionNLRP3 may be play an important role in the process of tuberculosis inflammation. This work provides new ideas for the laboratory diagnosis of tuberculosis and new clues for further exploring the pathogenesis mechanism of tuberculosis.

Tuberculosis; Periphery blood monocyte; NLRP3

國家自然科學(xué)基金(81401751)

唱?jiǎng)P，E-mail:changaki0203@163.com

R 521

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.031

2016-03-05； 編輯： 王小菊)