張 瓊　周廣芳　王中堂　單公華　劉孟軍　劉 平*

(1 山東省果樹研究所， 山東 泰安 271000)(2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)棗研究中心， 河北 保定 071001)

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棗類黃酮化合物的快速提取方法

張 瓊1,2周廣芳1*王中堂1單公華1劉孟軍2劉 平2*

(1 山東省果樹研究所， 山東 泰安 271000)(2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)棗研究中心， 河北 保定 071001)

針對(duì)棗類黃酮化合物提取中存在的耗時(shí)長(zhǎng)、含糖量高等問題，以“魯棗1號(hào)”為試材，采用紫外分光光度計(jì)和高效液相色譜進(jìn)行棗類黃酮化合物的快速提取方法研究。本研究從提取質(zhì)量、化合物數(shù)量、提取時(shí)間等多方面綜合比較溶劑超聲浸提法、融凍微波破壁法和簡(jiǎn)化QuEChERS法的提取效果，確定棗類黃酮化合物的快速提取方法。研究表明：簡(jiǎn)化QuEChERS法可在30 min內(nèi)有效提取棗類黃酮。具體步驟為：樣品加水渦旋5 min，然后加乙腈振蕩15 min，最后加NaCl離心分層，取上層乙腈相。整個(gè)過程歷時(shí)30 min，可有效去除部分糖類物質(zhì)。該方法簡(jiǎn)單、快速、有效。

棗；類黃酮；簡(jiǎn)化QuEChERS法；快速提取

棗(Ziziphus jujuba Mill.)是原產(chǎn)中國(guó)的具有極高的食用、藥用、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和科研價(jià)值的樹種，是我國(guó)第一大干果樹種，其產(chǎn)量占世界棗總產(chǎn)量的99%以上，因此其開發(fā)與利用占有絕對(duì)的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。

棗中除含有豐富的多糖、維生素、膳食纖維、環(huán)磷酸腺苷等功能物質(zhì)，還含有豐富的類黃酮類物質(zhì)[1-4]。類黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基能力，具有抗癌、抗衰老、抗炎、改善心腦血管脆性等生理功能，其中一些類黃酮化合物已被批準(zhǔn)用作醫(yī)藥品，例如蘆丁已是一種毛細(xì)血管脆性及靜脈曲張狀態(tài)的治療藥物。另外，類黃酮對(duì)植物體本身也有一定的調(diào)節(jié)作用，可以作為酶抑制劑、對(duì)植物有害的金屬的螯合劑以及還原劑等[5]。因此，充分開發(fā)與利用類黃酮，尤其是占世界總產(chǎn)量99%的棗中的類黃酮，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與廣闊的發(fā)展前景。

開發(fā)棗類黃酮首先要明確棗中含有的類黃酮物質(zhì)種類，常采用高效液相色譜與質(zhì)譜對(duì)提取液進(jìn)行分離鑒定，目前棗類黃酮的提取方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、融凍微波破壁提取法等，但棗中的糖含量很高，以上方法提取出的類黃酮提取液中含有大量的可溶性糖等雜質(zhì)，且耗時(shí)長(zhǎng)，不利于進(jìn)一步的檢測(cè)。因此，需要建立一種簡(jiǎn)單、高效、快速的除雜、利于檢測(cè)的提取方法。

QuEChERS是近年來國(guó)際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)，其步驟簡(jiǎn)單歸納為樣品粉碎→乙腈提取分離→鹽析除水→吸附劑除雜→上清液檢測(cè)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、精確度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)殘檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

本文以自主選育品種“魯棗1號(hào)”為試材，借鑒QuEChERS樣品前處理方法，并對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)化用于提取棗類黃酮化合物，并比較簡(jiǎn)化QuEChERS法與超聲波提取及融凍微波破壁提取效果，旨在為棗類黃酮的開發(fā)與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為自主選育的極早熟優(yōu)良品種“魯棗1號(hào)”，于2014年8月5日采于山東省果樹研究所棗資源圃，選取成熟度一致、大小均勻的果實(shí)，采后帶回實(shí)驗(yàn)室，用水沖去果面浮塵，削成1 mm薄片，液氮速凍后研磨成粉末狀，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2棗類黃酮提取的不同方法

1.2.1超聲波提取法

稱取棗樣品1 g，加入20 mL 60%乙醇水溶液，超聲提取40 min，離心取上清液，重復(fù)1次。

1.2.2融凍微波破壁提取法

稱取棗樣品1 g，加入20 mL 40%乙醇水溶液，置于-20℃冰箱中冷凍，至溶液完全凍結(jié)，取出，低火微波提取2min，離心取上清液，殘?jiān)貜?fù)凍結(jié)微波提取1次。

1.2.3簡(jiǎn)化QuEChERS提取法

稱取棗樣品1 g，加入10 mL蒸餾水，渦旋1 min后加入20 mL乙腈，超聲提取10 min，加入3. 6 g氯化鈉，搖勻靜置，10 000轉(zhuǎn)/分離心取上清液，重復(fù)提取1次，合并兩次的上清液，得待測(cè)液。

1.3類黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硝酸鋁比色法進(jìn)行含量測(cè)定。取1 mL待測(cè)液置于10 mL試管中，加入5%亞硝酸鈉水溶液0. 3 mL，搖勻，靜置5 min，再加入10%硝酸鋁水溶液0. 3 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液4. 0 mL，搖勻，用30%乙醇水溶液定容至刻度，靜置15 min后，于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算其含量。

1.4HPLC的檢測(cè)條件

提取液過0. 22 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件參考張瓊(2010)[6]的方法，具體為：HPLC(安捷倫1200)，反向C18色譜柱(LiChroCART，250×4. 6 mm i.d.)，柱溫30 ℃，流動(dòng)A為乙腈，流動(dòng)相B為1%甲酸水溶液，梯度洗脫。

1.5數(shù)據(jù)分析

不同提取方式提取出的類黃酮含量的比較采用Excel 2007進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1提取效率的比較

本試驗(yàn)共采用3種方法提取棗類黃酮，分別為簡(jiǎn)化QuEChERS提取法、超聲波提取和融凍微波破壁提取，第一種提取方法是借鑒農(nóng)殘檢測(cè)前處理方法QuEChERS法，將其進(jìn)行簡(jiǎn)化，其余兩種方法較常用。圖1為3種提取方式提取出來的類黃酮物質(zhì)的含量比較，以超聲波提取的類黃酮含量最高，為2. 54 mg/g，簡(jiǎn)化QuEChERS提取的類黃酮含量最低，為2. 28 mg/g，但經(jīng)方差分析三者未見明顯差異，說明簡(jiǎn)化QuEChERS法法與其它兩種常用方法提取量相當(dāng)，但該方法的提取時(shí)間較其它方法明顯減少，僅需30 min。融凍微波破壁提取過程微波提取所需時(shí)間雖然較少，但需先將樣品冷凍，此過程較為耗時(shí)。

圖1　簡(jiǎn)化QuEChERS法、超聲波提取法、融凍微波破壁提取法提取類黃酮含量比較

2.2色譜分離效果比較

因融凍微波破壁提取法與簡(jiǎn)化QuEChERS法提取到的棗黃酮醇含量相當(dāng)，而提取總用時(shí)較簡(jiǎn)化QuEChERS法多，因此色譜分離效果比較試驗(yàn)中只對(duì)簡(jiǎn)化QuEChERS法和提取量最高的超聲提取法獲得的提取液進(jìn)行了HPLC檢測(cè)，比較其分離效果。如圖2所示，在相同液相條件下，均可在兩種方法的提取液中檢測(cè)到8種類黃酮物質(zhì)，但超聲波提取液在HPLC檢測(cè)中雜峰較多，而簡(jiǎn)化QuEChERS法提取液檢測(cè)到的雜峰很少，說明后一種方法提取更有利于棗類黃酮的提取分離分析。

圖2　超聲波提取和簡(jiǎn)化QuEChERS法提取所得樣品提取液的高效液相色譜圖

3　討論與結(jié)論

棗的含糖量非常高，鮮棗含糖量幅度在13. 0%～35. 03%[7]，而干棗含糖量可達(dá)80. 86%～85. 63%，在類黃酮提取過程中，部分糖類物質(zhì)得以析出，對(duì)類黃酮的提取分離影響很大。而本試驗(yàn)中提到的簡(jiǎn)化QuEChERS法是基于鹽析液-液萃取技術(shù)的一種提取方法，是指在可與水混溶的有機(jī)溶劑的水溶液中加入鹽，利用目標(biāo)分析物和糖類雜質(zhì)在水相和有機(jī)相中的溶解度不同，鹽析可使提取液分相，將目標(biāo)分析物萃取到有機(jī)相中，達(dá)到快速分離純化的目的。目前，類似原理的類黃酮提取方法已在金銀花、銀杏等植物上得以應(yīng)用，效果理想[8,9]。

用乙腈-水混合溶液作為提取劑，可使棗中的類黃酮與可溶性糖等物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)有效分離，提純待測(cè)液，且提取劑與色譜、質(zhì)譜流動(dòng)相相匹配，不會(huì)出現(xiàn)明顯的試劑峰，利于成分分離與鑒定。具體步驟為：樣品加水渦旋5 min，之后加乙腈振蕩15 min，最后加NaCl離心分層，取上層乙腈相即得棗類黃酮提取液。簡(jiǎn)化QuEChERS法可在30 min內(nèi)有效提取棗類黃酮，簡(jiǎn)單、快速、有效，是一種利于分離鑒定檢測(cè)的快速提取棗類黃酮的方法。但鑒于乙腈的毒性，該方法不適用于生產(chǎn)，非常適用于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行物質(zhì)的快速分離與鑒定及其他相關(guān)試驗(yàn)。

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A Rapid and Efficient Extraction Method of Flavonoids from Ziziphus jujuba Fruits

Zhang Qiong1,2Zhou Guangfang1*Wang Zhongtang1Shan Gonghua1Liu Mengjun2LiuPing2*

(1 Shandong Institute of Pomology, Taian, Shandong 271000) (2 Research Center of Chinese Jujube, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001)

The objective of this study was to develop a simplified and rapid procedure for flavonoids extraction from jujube fruits. Flavonoids were extracted from the ripe edible fruits of jujube(Ziziphus jujuba ' Luzao 1' )using three methods, which were ultrasonic extraction, microwave-frozen-melted disintegrating method and simplified QuEChERS method. The extraction effects were comprehensively evaluated from quantity, quality and time by Uv-vis spectrophotometry and high-performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the simplified QuEChERS method was optimal. Detailed procedures were as follows: the grinded jujube fruits in liquid nitrogen were eluted by water for 5 minutes, and then acetonitrile was added to oscillate for 15 minutes. After oscillation, NaCl was added to the extracts. By centrifugal separation, the extracts were turned into two layers, the upper acetonitrile layer contained all the flavonoids. The entire procedure can be carried out in approximately 30 minutes, and effectively eliminate some saccharide. The simplified QuEChERS method is easy, rapid and efficient.

Ziziphus jujuba Mill; flavonoids; simplified QuEChERS method; rapid extraction

2015-08-02

山東省農(nóng)業(yè)良種工程(2014LZ12);山東省果樹研究所所長(zhǎng)基金(2013KY01);山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金(2014QNM34)。

張瓊(1982-)，女，在讀博士，助理研究員，研究方向?yàn)闂椘贩N選育及營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：qiong1982@163.com

?E-mail：gkskyb@sina.com

1009-0568(2016)03-0037-04

S662.9

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.007