劉蘭英，呂　新，陳麗華，李玥仁*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，福建　福州　350003；2.福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建　福州　350003)

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福州左海湖細菌群落的季節(jié)性變化特征及典范對應分析

劉蘭英1,2，呂新1,2，陳麗華1,2，李玥仁1,2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，福建福州350003；2.福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建福州350003)

為揭示福州左海湖細菌群落的季節(jié)變化及其與環(huán)境因子的關系，通過構(gòu)建16S rRNA 基因克隆文庫對全湖水體細菌群落進行了調(diào)查，應用典范對應分析(Canonical correspondence analysis，CCA)探討影響細菌群落季節(jié)性變化的環(huán)境因素。結(jié)果表明：左海湖細菌群落組成中β-變形菌門β-Proteobacteria和藍細菌門Cyanobacteria為優(yōu)勢類群，α-變形菌門α-Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes和放線菌門Actinobacteria為亞優(yōu)勢類群。細菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的季節(jié)性變化特征，春、夏季Cyanobacteria為優(yōu)勢類群，秋、冬季β-Proteobacteria為優(yōu)勢類群。春季水體細菌群落結(jié)構(gòu)主要受pH、葉綠素a(Chla)、透明度(SD)和總氮(TN)的影響，夏季水體受pH、Chla、SD、總磷(TP)影響較大，秋季水體受TP、Chla、TN影響較大，冬季水體則受水溫(WT)、pH、SD影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)，左海湖細菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)動態(tài)與水溫及營養(yǎng)狀況密切相關。

左海湖；細菌群落；16S rRNA 基因克隆文庫；季節(jié)變化；典范對應分析

湖泊生態(tài)系統(tǒng)中細菌種類繁多且數(shù)量龐大，約105～108個·mL-1，占湖泊中生物量的絕大部分，是湖泊環(huán)境中食物網(wǎng)和食物鏈的重要組成部分[1- 2]。細菌對湖泊生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有調(diào)控作用，細菌群落結(jié)構(gòu)是其整體功能的表現(xiàn)，湖泊細菌群落的組成與特性在一定程度上反映了湖泊生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境狀況[3]。因此研究湖泊細菌的群落組成、多樣性的季節(jié)差異，對于了解細菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)功能演替中的作用是非常必要的。

對水體細菌多樣性的研究已有很多報道，主要集中于湖泊、水庫、溪流、海洋等環(huán)境[4]，尤其是湖泊細菌多樣性研究越來越受到研究者的關注。許多研究表明，湖泊營養(yǎng)狀況不同，湖泊細菌的群落結(jié)構(gòu)組成也各不相同[5-6]。Zhang等[7]借助克隆文庫和基因芯片相結(jié)合的分子生物學技術(shù)，對青藏高原高山湖泊細菌多樣性的研究表明，鹽濃度和海拔與該湖泊中的細菌群落結(jié)構(gòu)呈顯著性相關。Adams等[8]通過研究北極24個湖泊和溪流樣品中的細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)水體的溫度在這些生境的細菌群落組成中起著關鍵作用。

左海湖位于福州市西北部，是典型的半封閉式淺水湖泊，是福州市民主要的休閑和娛樂場所之一。自2008年發(fā)現(xiàn)被稱為“左海水怪”的不名果凍狀生物體以來，左海湖的水體質(zhì)量狀況已引起了廣泛的社會關注?！八帧钡某霈F(xiàn)可能與左海湖環(huán)境因子發(fā)生了變化有關，而湖泊中微生物群落的動態(tài)變化對湖泊環(huán)境具有較好的指示作用[9]。本研究在左海湖設置4個采樣點，基于構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫的方法，對湖區(qū)細菌群落組成及季節(jié)變化規(guī)律進行了研究，并分析細菌群落組成與水體環(huán)境因子間的關系，以期為左海湖水環(huán)境質(zhì)量評價及污染防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣品采集

分別于2012年2月(冬季)、4月(春季)、8月(夏季)和10月(秋季)在左海湖進行水樣采集。設置4個采樣點，具體采樣位置的經(jīng)緯度信息見表1，每個取樣站位設置3個重復，所有樣品采集完成后立即放入帶有冰塊的保溫箱中運回實驗室，用于后續(xù)試驗分析。

1.2左海湖環(huán)境因子的測定

采用透明度盤對水體的透明度(SD)進行現(xiàn)場測定，其他環(huán)境因子均在實驗室內(nèi)完成測定。水體的pH值通過酸度計(PE20，梅特勒)測定；采用90%丙酮萃取熒光分光光度法對水體的葉綠素a含量進行測定[10]；總氮(TN)、總磷(TP)含量和高錳酸鉀指數(shù)(COD)測定方法均參照王心芳等[11]的報道。

1.3水體細菌的收集與基因組DNA的提取

采用8 μm孔徑的定性濾紙，將水樣中的大部分顆粒雜質(zhì)及真核生物過濾除去，再通過聚碳酸酯微孔薄膜(Whatman，0.2 μm，47 mm) 進行真空抽濾，然后用無菌水洗滌濾膜2～3次，取下濾膜并將其剪碎后裝入1.5 mL離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?。水體細菌總基因組DNA的提取參考Wu等[12]的報道。

1.4細菌16S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建與篩選

采用細菌16S rRNA序列通用型引物27f (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) 和1492r (5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)[13]進行PCR擴增，設置3組試驗重復，PCR擴增方法參考Wu等[4]的報道。反應程序：①94℃，3 min；②94℃，30 s；③60℃，1 min；④72℃，60 s。共30個循環(huán)，最后再72℃延伸10 min?；旌? 組平行的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa公司)，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。通過藍白斑法篩選陽性克隆，用測序引物M13f和M13r進行菌落PCR鑒定，PCR擴增體系和反應條件同上。

1.5酶切分析與測序

將驗證為陽性重組子的質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定，所用的限制性內(nèi)切酶為Csp6 I和Hinf I[14]，通過2.5%～3.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離驗證酶切產(chǎn)物。借助Photoshop軟件分析酶切譜型，統(tǒng)計各泳道的酶切條帶數(shù)和大小，將完全相同的酶切譜型進行歸類，并計算每個酶切譜型出現(xiàn)的頻率，挑取具有不同譜型的克隆子到生工生物工程(上海)有限公司進行測序。測序獲得的16S rRNA基因序列通過DNAMAN 8.0軟件進行相互比較，將16S rRNA基因序列相似性大于或者等于97% 的劃為一個操作分類單元 (Operational Taxonomic Units，OTU)。

1.6數(shù)據(jù)分析

細菌多樣性根據(jù)Shannon-Wiener指數(shù)(H′)和Simpson指數(shù)(1/D)[15]進行分析，均勻度指數(shù)(E)可以反映群落中各個物種多度分布的均勻程度，其計算參考邱小琮等[16]的報道，采用文庫覆蓋率(Coverage C)評估所構(gòu)建的文庫對目標環(huán)境微生物多樣性的體現(xiàn)程度[4]。具體計算公式如下：

(1)

(2)

式中，Pi=ni/N，ni為第i種OTU的克隆數(shù)，N為總克隆數(shù)。

E=H′/Hmax

(3)

式中，Hmax為最大Shannon指數(shù)，大小為log2S，S為克隆文庫中總OTU種類數(shù)。

C=(1-n1/N)×100%

(4)

式中，n1代表在16SrRNA基因克隆文庫中僅出現(xiàn)一次的OTU數(shù)量，N為總克隆數(shù)。

通過CanocoforWindows4.5應用軟件對群落組成數(shù)據(jù)和環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行典范對應分析，探討細菌群落與環(huán)境因子之間的關系，分析時除了pH值，其余數(shù)據(jù)均進行l(wèi)og(x+1)轉(zhuǎn)換[17-18]，采用Origin8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析并作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1環(huán)境因子季節(jié)動態(tài)

左海湖各環(huán)境因子指標呈現(xiàn)季節(jié)性的變化規(guī)律(表1)。湖水各季節(jié)的pH值介于7.1～7.9，均呈弱堿性；水溫(WT)變化幅度為12.8～32.2℃，四季分明；透明度(SD)的變化范圍介于20～48cm，在秋季呈現(xiàn)最低值；化學需氧量(COD)的變化幅度較小，波動范圍介于7.63～10.51mg·L-1；總氮(TN)含量的變化幅度較大，在0.39～1.28mg·L-1之間波動，其中夏季各采樣點的總氮含量均較高；總磷(TP)含量的波動范圍在0.023～0.052mg·L-1，在夏季呈現(xiàn)最高值，冬季呈現(xiàn)最低值。葉綠素a(Chla)含量的變化范圍介于0.012～0.048mg·L-1，在冬季呈現(xiàn)最低值，其余季節(jié)變化規(guī)律不顯著。

表1　左海湖水體理化指標

注：①S1～S4代表左海湖4個不同的采樣站位；②表格中的數(shù)值代表平均值±標準差(3組平行試驗的標準差)。

2.2克隆文庫分析

每個季節(jié)樣品分別構(gòu)建1個16S rRNA基因克隆文庫，并在每個文庫中隨機挑取120個克隆子。通過菌落PCR驗證后共得到412個陽性克隆子，其中春季115個，夏季105個，秋季101個，冬季91個。通過限制性內(nèi)切酶Csp6Ⅰ和HinfⅠ對4個季節(jié)文庫中獲得的陽性克隆子進行酶切鑒定，共計得到298個酶切結(jié)果。

分別計算4個季節(jié)文庫的覆蓋率Coverage(C)、Shannon-Wiener指數(shù)(H′)、Simpson 指數(shù)(1/D)和均勻度指數(shù)(E)(表2)，以比較各季節(jié)樣品的細菌群落多樣性與豐富度。從表2可以看出，各季節(jié)樣品的文庫覆蓋率(C)為69.5% ～79.1%。張勝男等[19]在梁素海浮游細菌群落結(jié)構(gòu)研究中指出，當湖區(qū)克隆文庫的覆蓋率為65.2%～75.4%時，表明文庫基本可代表細菌群落結(jié)構(gòu)的組成。因此，由表2中的文庫覆蓋率范圍可知，本研究所構(gòu)建的克隆文庫較為理想，可以很好地反映左海湖中細菌群落的多樣性。

多樣性分析表明，春、夏、秋、冬各季節(jié)文庫的Shannon-Wiener指數(shù)分別為2.85、3.30、3.29和3.52，其中冬季樣品的HShannon-Wiener指數(shù)和HSimpson指數(shù)均為最高，說明其細菌群落多樣性最豐富；相比之下，春季樣品的HShannon-Wiener指數(shù)和HSimpson指數(shù)均較低，說明其細菌群落多樣性較低。從均勻度指數(shù)(E)可以看出，各克隆文庫中細菌群落的均勻度較為接近，和多樣性指數(shù)變化趨勢一致。

表2　左海湖細菌16S rRNA基因克隆文庫分析結(jié)果

2.3細菌群落組成的季節(jié)動態(tài)

將所構(gòu)建克隆文庫的16S rRNA基因片段送上海生工進行雙向測序，測序結(jié)果中的上、下游序列通過Invitrogen軟件拼接。根據(jù)97%序列相似性原則，將所有季節(jié)文庫中得到的克隆子劃分為169個OTUs類型。BLAST比對結(jié)果顯示，大部分OTUs(90%以上)的16S rRNA基因序列與GenBank 中已知序列具有很高的相似度(97%～100%)。本試驗中獲得的412個陽性克隆子代表的169種基因型歸屬為11門一級的細菌分類單元，分別來自變形菌門的α-，β-，γ-和δ-亞族、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、藍細菌門Cyanobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、酸桿菌門Acidobacteria、疣微菌門Verrucomicrobia和厚壁菌門Firmicutes。

不同細菌類群組成的季節(jié)性變化較大(圖1)，在各季節(jié)中均大量分布的細菌類群是β-Proteobacteria和Cyanobacteria。其中，β-Proteobacteria在秋、冬季比例較高，在春季比例相對較低，為秋、冬季文庫的優(yōu)勢細菌類群；Cyanobacteria在春、夏季最豐富，尤其在春季，該細菌類群占了絕對的優(yōu)勢地位。α-Proteobacteria在4個不同季節(jié)中均有發(fā)現(xiàn)，春冬季比例較高，夏秋季比例較低。Actinobacteria和Bacteroidetes在不同季節(jié)里都有分布，冬季數(shù)量較多，其他季節(jié)較少。除了上述幾大主要的細菌類群，一些非優(yōu)勢類群，如Chloroflexi、Verrucomicrobia、Firmicutes等并未在所有季節(jié)里均有檢測到，而且所占的比例也較少，這可能與研究中所采用的16S rRNA基因文庫構(gòu)建方法無法很好地獲取環(huán)境中的非優(yōu)勢細菌類群有關。

2.4細菌群落與環(huán)境因子的CCA分析

不同季節(jié)細菌群落組成與環(huán)境因子之間的關系如圖2所示。依據(jù)除趨勢對應分析(DCA)，物種分布的最大梯度長度為2.040(<3.0)，具有明顯的線性模型特征[20]，因此選擇冗余分析(RDA)探討細菌群落組成與環(huán)境因子之間的相關性。本研究中環(huán)境因子第1、2主軸間的相關系數(shù)為0，說明排序結(jié)果是可信的，圖中箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負相關性[21-22]。從RDA分析圖中可以看出，不同季節(jié)細菌群落受環(huán)境因子影響不同，本研究選取的7 個環(huán)境因子對細菌群落結(jié)構(gòu)都有一定程度的影響。春季水體細菌的分布主要受Chla、pH、SD和TN的影響，排序軸1與Chla(r= -0.959 1)、pH(r=-0.873 7)、SD(r=-0.814 4)呈負相關，軸2與TN(r=-0.767 0)呈負相關；夏季水體細菌的分布受pH、SD、TP、Chla的影響較大，軸1與pH(r=-0.960 7)、TP(r=-0.769 3)、Chla(r=-0.742 7)呈負相關，軸2與SD(r=-0.796 1)負相關；秋季水體細菌的分布主要受TP、Chla、TN的影響，環(huán)境因子與主軸1的相關性較大，其中呈正相關的為TP(r=0.995 3)、TN(r=0.920 8)，與Chla(r=-0.941 1)呈負相關；冬季水體細菌的分布受WT、pH、SD影響較大，環(huán)境因子與主軸2的相關性較大，其中呈正相關的為pH(r=0.985 3)，呈負相關的為WT(r=-0.983 3)和SD(r=-0.793 4)。

3　討論與結(jié)論

與其他已知淡水生境細菌類群的組成情況[4-5]相似，本研究結(jié)果表明，左海湖水體中常見的細菌類群為α-變形菌門α-Proteobacteria、β-變形菌門β-Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes和藍細菌門Cyanobacteria，其季節(jié)分布特征表現(xiàn)為β-Proteobacteria和Cyanobacteria在所有季節(jié)里所占的比例均最高。春、夏季Cyanobacteria為優(yōu)勢類群，秋、冬季β-Proteobacteria為優(yōu)勢類群。β-Proteobacteria和Cyanobacteria通常被認為在富營養(yǎng)化水體中占優(yōu)勢[4, 6]，因此在左海湖檢測到豐富的β-Proteobacteria和Cyanobacteria細菌類群在某種程度上說明了左海湖水質(zhì)狀況發(fā)生了變化。而優(yōu)勢類群顯著的季節(jié)性變化，原因可能為春、夏季氣溫高，有利于Cyanobacteria的生長，因此Cyanobacteria數(shù)量通常有所上升，甚至占了絕對的優(yōu)勢地位，由于種間競爭的加劇，導致β-Proteobacteria數(shù)量有所下降。另外，β-Proteobacteria和Cyanobacteria在季節(jié)性變化過程中存在明顯的此消彼長的規(guī)律，還可能與水體中營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生變化有關[23]，水體中營養(yǎng)物質(zhì)的高低會導致一些細菌的生長受到促進或抑制。

本研究對福州左海湖水體的細菌群落組成、環(huán)境因子進行典范對應分析，結(jié)果表明環(huán)境因子對不同季節(jié)里細菌群落組成的影響程度明顯不同。造成左海湖細菌群落結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境因子包括水體的pH、水溫、總氮、總磷和葉綠素a，表明左海湖細菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的季節(jié)變化，并且與湖泊中的環(huán)境因子有著不可分割的密切關系，這與Pollet等[24]，Du等[25]，Wang等[26]的研究結(jié)果類似。氮、磷是水體主要營養(yǎng)污染物[27]，通過環(huán)境因子季節(jié)動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，春、夏、秋季左海湖水的總氮、總磷含量均高于冬季，表明這期間湖水富營養(yǎng)化程度比冬季湖水嚴重。已有研究表明，富營養(yǎng)化湖泊中碳酸鹽的化學平衡決定著水體pH的變化，而碳酸鹽體系的化學平衡又受到藻類種群生長、轉(zhuǎn)化，光合、呼吸作用等過程的影響，藻類初級生產(chǎn)力與水體的pH相關性顯著[28-29]。本研究中細菌群落組成與水體pH的相關性可能是由不同水環(huán)境條件下藍細菌的生長繁殖變化導致的。藍細菌是一類光能營養(yǎng)微生物，其數(shù)量在春、夏季最豐富，這可能與春、夏季水體具有更為豐富的有機營養(yǎng)，較高的水體溫度以及較強的光照強度等有關。另有研究表明葉綠素a含量的高低體現(xiàn)了藻類生物量的多少[30]，本研究中我們發(fā)現(xiàn)藍細菌在春、夏、秋季都比較豐富，而葉綠素a含量在這3個季節(jié)里也都比較高。因此，認為左海湖細菌群落與水體葉綠素a含量的相關性也可能是由不同季節(jié)時期藍細菌的生長繁殖變化導致的。

本研究通過構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫的方法，探討了福州左海湖中不同季節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)的組成，該方法對于細菌群落多樣性研究有一定幫助，但也存在一定的局限性。該方法主要采用隨機挑選克隆子的方法，可能會高估目標環(huán)境中優(yōu)勢細菌群落的豐富度，不能了解環(huán)境中的非優(yōu)勢細菌群落，而那些數(shù)量上不占優(yōu)勢的細菌類群可能對水體環(huán)境也起著重要的作用。近年來流行的高通量測序技術(shù)可以更為精確的研究環(huán)境中微生物群落的多樣性，已逐漸得到廣泛應用，今后研究中可結(jié)合高通量測序技術(shù)對左海湖中的細菌群落組成進行更全面認識。

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(責任編輯：林海清)

Seasonal Changes on and Environmental Factors Affecting Bacterial Community at Zuohai Lake in Fuzhou

LIU Lan-ying1, 2, Lü Xin1, 2, CHEN Li-hua1, 2, LI Yue-ren1, 2*

(1.InstituteforAgriculturalStandardsandTestingTechnology,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fuzhou，F(xiàn)ujian350003,China; 2.KeyLaboratoryforPrecisionInstrumentTestsinAgriculturalFields,Fuzhou，F(xiàn)ujian350003,China)

To determine the seasonal changes on and the environmental factors that affected the bacterial community at Zuohai Lake in Fuzhou, a survey was conducted at 4 sampling sites on the lake from February to August in 2012. A genetic library of their 16S rRNA gene clones was established. Canonical correspondence analysis (CCA) was used to examine the correlation between the bacterial diversity and the environmental factors. The results indicated thatβ-ProteobacteriaandCyanobacteriawere the predominate lineages in the water, followed byα-Proteobacteria,Bacteroidetes, andActinobacteria. A significant seasonal variation in composition of the bacterial community was detected. Among various categories of bacteria,Cyanobacteriaappeared most dominant in the spring and summer; whileβ-Proteobacteria, in the autumn and winter. The results of CCA showed that the bacterial community in the water was mainly affected by pH, chlorophyll a (Chla), transparency (SD), and total nitrogen (TN) in the spring; pH, Chla, SD, and total phosphate(TP), in the summer; TP, Chla, and TN in the fall; and, water temperature, pH, and SD, in the winter. Thus, in general, the bacterial growth in the lake closely related to the temperature as well as the nutrients available in the water.

Zuohai lake; bacterial community; 16S rRNA gene clone library; seasonal changes; canonical correspondence analysis

2016-03-22初稿；2016-04-30修改稿

劉蘭英(1987-)，女，研究實習員，研究方向：環(huán)境微生物多樣性

李玥仁(1966-)，男，研究員，研究方向：微生物多樣性與生物安全(E-mail: yuerenli@yeah.net)

福建省自然科學基金項目(2011J01118)；福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1025-9)

Q 938.8; X 172

A

1008-0384(2016)07-758-07

劉蘭英，呂新，陳麗華，等.福州左海湖細菌群落的季節(jié)性變化特征及典范對應分析[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31(7)：758-764.

LIU L-Y，Lü X，CHEN L-H，et al.Seasonal Changes on and Environmental Factors Affecting Bacterial Community at Zuohai Lake in Fuzhou[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：758-764.