王　霞，許菊香,于曉明,徐亞維

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林　吉林　132101；2.長白山動植物資源利用與保護吉林省高校重點實驗室，吉林　吉林　132101；3.磐石市農(nóng)民科技教育中心，吉林　磐石　132300)

?

尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及其抗菌和抗氧化作用

王霞1,2，許菊香3,于曉明1，2,徐亞維1,2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101；2.長白山動植物資源利用與保護吉林省高校重點實驗室，吉林吉林132101；3.磐石市農(nóng)民科技教育中心，吉林磐石132300)

研究尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳提取方法、提取工藝及其抗菌和抗氧化能力。采用水蒸氣蒸餾法(SD法)和CO2超臨界流體萃取法(SFE-CO2法)提取尾葉香茶菜揮發(fā)油，通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，采用體外抑菌試驗和對DPPH自由基的清除能力試驗研究其抗菌和抗氧化能力。結(jié)果表明，SD法的最佳提取工藝是浸泡時間8 h，料液比1∶6，蒸餾時間7 h，平均得油率為0.186%；SFE-CO2法的最佳提取工藝是萃取壓力30 MPa，萃取溫度50℃，萃取時間80 min，平均得油率為0.440%；2種方法所提揮發(fā)油均具有一定的抑菌和DPPH自由基的清除能力，且SFE-CO2法所提揮發(fā)油的抗菌和抗氧化能力均高于SD法所提揮發(fā)油，同種方法所提揮發(fā)油的抑菌效果：枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌；對DPPH自由基的清除能力強弱：SFE-CO2法提取揮發(fā)油>SD法提取揮發(fā)油>Vc。優(yōu)化的2種提取方法穩(wěn)定性好，其中SFE-CO2法周期短、工藝流程簡單、得油率高、抗菌和抗氧化性能好，適宜在工業(yè)生產(chǎn)中推廣。

尾葉香茶菜；揮發(fā)油；提取工藝；抗菌；抗氧化

尾葉香茶菜Isodonexcisa(Maxim.) Hara，系多年生草本植物，主要分布于我國吉林、甘肅、山西等省以及日本、朝鮮、俄羅斯的遠東地區(qū)[1]。尾葉香茶菜全草入藥，具有清熱解毒、健胃、活血等功效，可用于治療胃炎、膀胱脹痛和感冒發(fā)熱等疾病[2]。目前，對尾葉香茶菜的研究主要集中在化學(xué)成分方面，尤其是二萜類化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定及藥理活性等方面，藥理研究表明，這些化合物可以顯著抑制人體宮頸癌細胞、黑色素瘤細胞、肺癌細胞等腫瘤細胞的增殖[3]。

揮發(fā)油是存在于植物中的可隨水蒸蒸汽蒸餾出來的油狀液體，多具有抗菌、殺蟲、抗氧化等生物活性，不同植物的揮發(fā)油組成成分不同，生物活性也不相同[4]。目前，對尾葉香茶菜揮發(fā)油的研究較少，僅見那微、南敏倫對尾葉香茶菜揮發(fā)油的化學(xué)成分進行了分析[1,5]，而關(guān)于尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及生物活性方面的研究則尚無報道。目前香茶菜屬植物的揮發(fā)油都是從陰干后的材料中提取的，由于揮發(fā)油易揮發(fā)，陰干耗時長，因此很容易流失一些揮發(fā)油成分，降低得油率。本試驗首次以新鮮尾葉香茶菜為材料，利用水蒸氣蒸餾法(SD法)和CO2超臨界流體萃取法(SFE-CO2法)提取揮發(fā)油，借助正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，并對2種方法提取揮發(fā)油進行抗菌和DPPH自由基清除能力測定與分析，為尾葉香茶菜的進一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與菌株

材料：野生尾葉香茶菜，于2015年7月采自吉林市龍?zhí)渡剑?jīng)吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院孫倉教授鑒定為尾葉香茶菜。

供試菌株：金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus、大腸桿菌Escherichiacoli和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2設(shè)備與試劑

HA121-50-1型超臨界萃取裝置設(shè)備(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)，R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琪)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海鑫福電子科技有限公司)，723型可見分光光度計(上海光學(xué)儀器一廠)。

DPPH自由基(Sigma公司)；無水乙醚，無水硫酸鈉、LB培養(yǎng)基等，均為分析純。

1.3試驗方法

1.3.1揮發(fā)油的提取

(1)SD法：稱取新鮮尾葉香茶菜1 000 g，剪碎，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中浸泡一段時間(表1)，然后提取揮發(fā)油，提取溫度100℃，提取液用無水乙醚萃取，無水硫酸鈉干燥[6]，收集揮發(fā)油，計算得油率。

得油率/%=(揮發(fā)油質(zhì)量/原材料質(zhì)量)×100%[7]

根據(jù)預(yù)試驗，考查浸泡時間、料液比和蒸餾時間對尾葉香茶菜得油率的影響，每個因素設(shè)3個水平，按照L9(33)正交表進行試驗，考查因素表如表1所示。

(2)SFE-CO2法：稱取新鮮尾葉香茶菜200 g，剪碎，放入萃取釜中提取。調(diào)節(jié)萃取壓力和萃取溫度，同時設(shè)置分離釜I：壓力8 MPa，溫度50℃；分離釜：壓力10 MPa,溫度55℃，待壓力平衡后計算萃取時間，一段時間后收集萃取物。

根據(jù)預(yù)試驗，考查萃取壓力、萃取時間和萃取溫度對尾葉香茶菜得油率的影響，每個因素設(shè)3個水平，按照L9(33)正交表進行試驗，考查因素表如表3所示。

1.3.2抑菌活性試驗

(1)供試菌液的制備：利用LB斜面培養(yǎng)基分別活化3種供試菌株，收集對數(shù)生長期菌株于生理鹽水中，制成含量約為1×108cfu·mL-1的供試菌液，備用[8]。

(2)抑菌圈直徑的測定：將用SFE-CO2法在最佳工藝條件下提取的揮發(fā)油和SD法提取的揮發(fā)油分別與無水乙醚按1∶1體積比混勻，用濾紙片擴散法測定抑菌效果：將3種供試菌液分別涂布在平板上，將直徑為6 mm的無菌濾紙浸于揮發(fā)油溶液中，10 min后取出晾干，置于含菌平板上，每皿3片，1片為含揮發(fā)油濾紙，1片為只浸有乙醚的濾紙(空白對照)，1片為浸有0.1 mg·mL-1慶大霉素的濾紙(陽性對照)，重復(fù)試驗4次，37℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑[9]。

(3)最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定：采用2倍連續(xù)梯度稀釋法，用無水乙醚稀釋揮發(fā)油原液，使揮發(fā)油的體積分數(shù)依次為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μL·L-1，將無菌濾紙片分別浸泡于不同濃度的揮發(fā)油稀釋液中，使之充分吸收并晾干后，置于含菌平板上，每皿3片，其中1片為只浸有乙醚的濾紙(空白對照)，重復(fù)試驗4次，37℃培養(yǎng)24 h，測定尾葉香茶菜揮發(fā)油的MIC，將低于揮發(fā)油MIC的未長菌的平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，仍無菌生長的最低濃度即為揮發(fā)油的MBC[10]。

1.3.3DPPH自由基清除試驗參照鄧大貴等[11]的方法并改良，取2 mL不同質(zhì)量濃度的揮發(fā)油(5、15、30、45 μg·mL-1)和2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基強烈震蕩混勻，避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光值，乙醇代替DPPH自由基為對照組，乙醇代替揮發(fā)油樣品為空白組，維生素C(Vc)為陽性對照，試驗重復(fù)3次，計算DPPH自由基清除率。

清除率/%={[1-(A樣品-A對照)]/A空白}×100%[11]

2　結(jié)果與分析

2.1SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油

正交試驗及極差分析結(jié)果如表1所示，可以看出RC>RA>RB，極差越大對尾葉香茶菜揮發(fā)油得油率的影響越大，反之影響越小，因此各因素對得油率的影響次序是：C(蒸餾時間)>A(浸泡時間)>B(料液比)，由方差分析結(jié)果(表2)可以看出，A(浸泡時間)因素和C(蒸餾時間)因素對得油率有顯著影響(P<0.05)，B(料液比)因素對得油率無顯著影響，影響程度排序與極差分析結(jié)果一致。綜上，SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳工藝為A3B2C2，即浸泡時間8 h，料液比1：6，蒸餾時間7 h，在此條件下進行驗證試驗，重復(fù)3次，得油率依次為0.183%、0.188%、0.187%，平均得油率為0.186%，該最佳工藝條件重復(fù)性良好。

表1　SD法正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表2　SD法方差分析

注：R2=0.991(調(diào)整R2=0.966)。

2.2SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油

正交試驗及極差分析結(jié)果如表3所示，可以看出RA>RB>RC，各因素對尾葉香茶菜揮發(fā)油得油率的影響次序是：A(萃取壓力)>B(萃取溫度)>C(萃取時間)，方差分析結(jié)果如表4所示，可以看出，萃取壓力和萃取溫度對得油率影響顯著(P<0.05)，萃取時間對得油率影響不顯著，影響程度排序與極差分析結(jié)果一致。綜上，SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳工藝條件為A2B2C2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度50℃，萃取時間80 min，但是由于萃取時間對得油率影響不大，縮短時間又可以縮短工業(yè)生產(chǎn)周期，故筆者認為應(yīng)選擇的最佳工藝條件是A2B2C1，在此條件下進行驗證試驗，重復(fù)3次，得油率依次為0.438%、0.440%、0.443%，平均得油率為0.440%，該最佳工藝條件重復(fù)性良好。

表3SFE-CO2法正交試驗設(shè)計與結(jié)果

Table 3Orthogonal test and analysis on results for SFE extraction

表4　SFE-CO2 法方差分析

注：R2=0.992(調(diào)整R2=0.966)。

2.3抑菌活性試驗

抑菌圈是揮發(fā)油在培養(yǎng)基中擴散抑制菌株生長形成的透明圈，最低抑菌濃度(MIC)是能夠抑制細菌生長的最低抑菌劑濃度，最低殺菌濃度(MBC)是能夠殺死99.9%以上菌株的抑菌劑濃度，因此抑菌圈越大，MIC和MBC越小，抑菌活性就越強。尾葉香茶菜揮發(fā)油的抑菌活性試驗結(jié)果如表5所示，可知SFE-CO2法和SD法所提揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有較強的抑殺作用，同種方法所提揮發(fā)油對枯草芽孢桿菌抑殺效果最好，金黃色葡萄球菌次之，對大腸桿菌抑殺效果較弱。對于同一種供試菌株，SFE-CO2法提取揮發(fā)油比SD法提取揮發(fā)油對供試菌株的抑菌圈直徑大，MIC小，MBC也小于或等于SD法所提揮發(fā)油，因此SFE-CO2法所提揮發(fā)油對3種供試菌的抑菌活性高于SD法所提揮發(fā)油。

表5　尾葉香茶菜揮發(fā)油的抑菌活性

注：A為金黃色葡萄球菌，B為大腸桿菌，C為枯草芽孢桿菌, -表示無抑菌圈。

2.4對DPPH自由基的清除試驗

DPPH自由基，全稱1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一種含有3個苯環(huán)的穩(wěn)定性較好的自由基，醇溶液為紫色，在517 nm處有最大吸收峰，DPPH自由基具有單電子，可與抗氧化劑配對使其吸收減少，因此吸光值越小，對自由基的清除率就越大，抗氧化性也就越強[12]。尾葉香茶菜揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率如圖1所示，可知SD法和SFE-CO2法所提揮發(fā)油對DPPH自由基均具有顯著的清除作用，在測定濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基的清除能力均隨揮發(fā)油濃度升高而增強，SD法曲線回歸方程為Y=1.713X+13.720，R2=0.994，半數(shù)清除率EC50為21.179 μg·mL-1，SFE-CO2法曲線回歸方程為Y=1.822X+16.211，R2=0.982，半數(shù)清除率EC50為18.545 μg·mL-1，以半數(shù)清除率EC50為評價指標(biāo)，兩種方法所提揮發(fā)油與陽性對照Vc相比差別顯著，結(jié)果為SFE-CO2法提取揮發(fā)油(18.545 μg·mL-1)SD法提取揮發(fā)油>Vc。

3　討論與結(jié)論

作為植物揮發(fā)油提取的傳統(tǒng)方法，SD法的優(yōu)點是設(shè)備簡單、操作方便、成本低廉和不污染環(huán)境，缺點是提取時間長、成分易揮發(fā)、提取率低、揮發(fā)油長時間受熱易焦化變質(zhì)[13]。試驗中SD法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳蒸餾時間是7 h，得油率為0.186%。SFE-CO2法是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種新型物質(zhì)分離技術(shù)，SFE-CO2具有優(yōu)良的溶劑能力，能夠有效分離基質(zhì)和萃取物[14]。SFE-CO2法提取植物揮發(fā)油具有得油率高、雜質(zhì)少、提取時間短、操作方便等優(yōu)點，本試驗利用該法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油的最佳萃取溫度是50℃，系統(tǒng)封閉和低溫可以避免熱敏性和易氧化成分的破壞，最佳萃取時間是80 min，低于SD法提取時間的1/5，大大縮短了生產(chǎn)周期，該條件下的得油率為0.440%，是SD法的2.366倍。抑菌活性試驗表明SD法和SFE-CO2法提取的揮發(fā)油均能顯著抑殺2種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)和1種革蘭陰性菌(大腸桿菌)，DPPH自由基清除試驗表明2種方法提取揮發(fā)油均具有較顯著的抗氧化作用， SFE-CO2法提取揮發(fā)油的抗菌、殺菌和抗氧化活性均高于SD法提取揮發(fā)油，因此筆者認為利用SFE-CO2法提取尾葉香茶菜揮發(fā)油值得推廣應(yīng)用。

綜上可知SFE-CO2法提取的揮發(fā)油具有顯著的體外抑菌和抗氧化能力，但對揮發(fā)油中發(fā)揮作用的具體活性成分并不清楚，下一步將對尾葉香茶菜揮發(fā)油的活性成分進行分離和鑒定，為尾葉香茶菜的開發(fā)應(yīng)用以及新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

[1]那微,鮑建材,劉剛,等.中藥尾葉香茶菜研究現(xiàn)狀及藥用前景展望[J].人參研究, 2006,18(1)：13-17.

[2]張寧,李春.尾葉香茶菜化學(xué)成分研究[J].中藥材,1998,21(7)：347-349.

[3]劉亞男,金永日,鐘加滕,等.尾葉香茶菜二萜類化合物B對人宮頸癌細胞的生長抑制作用及其機制[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2010,36(1)：54-58.

[4]秦姣.毛竹葉揮發(fā)油的提取及抑菌作用的研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010.

[5]南敏倫,趙雪嬌,張玲,等.尾葉香茶菜揮發(fā)油的成分研究[J].中國醫(yī)藥指南,2010,8(10)：5-6.

[6]納智.疏花毛萼香茶菜揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志,2005,30 (16)：1268-1270.

[7]陳聯(lián)邦.辛夷揮發(fā)油不同提取工藝的優(yōu)化及成分比較[D].長春：吉林大學(xué),2007.

[8]趙兵,郝萍,高昂,等.纈草與蜘蛛香揮發(fā)油的抗菌抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(8)：1037-1040,1066.

[9]耿紅梅,張彥,苗慶峰,等.白花菜子揮發(fā)油化學(xué)成分、抗氧化活性和抑菌活性的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(11)：194-199.

[10]葛曉曉,姚成,邊敏,等.長春七根揮發(fā)油的測定及抑菌活性研究[J].南京師范大學(xué)學(xué)報：工程技術(shù)版,2015,15(1)：67-72.

[11]鄧大貴,葉青,葉紅德,等.DPPH·法評價Vc、異Vc及其衍生物的抗氧化性能[J].食品工業(yè)科技,2008,29(4)：113-115.

[12]樊金玲,羅磊,武濤,等.沙棘籽原花色素與葡萄籽原花青素抗氧化活性的比較[J].食品與機械,2007,23(2)：26-30.

[13]杜麗君.胡椒木精油提取、分析及抗氧化特性研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2013.

[14]曾鎖林,丁煥文.CO2超臨界流體萃取的新進展[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2009, 30(2)： 31-33.

(責(zé)任編輯：黃愛萍)

Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia

WANG Xia1,2, XU Ju-xiang3, YU Xiao-ming1,2，XU Ya-wei1,2

(1.CollegeofJilinAgricultureScienceAndTechnology,Jilin,Jilin132101,China;2.KeyLaboratoryofChangbaiMountainAnimalandPlantRescources′UtilizationandProtectionofUniversitiesinJilinProvince,Jilin,Jilin132101,China;3.Farmers′ScienceandTechnologyEducationCenterofPanshiCity,Panshi,Jilin132300,China)

Extraction, as well as the antibacterial and antioxidative properties, of the volatile oil fromIsodonexciawere studied. The volatile oil was extracted by means of the steam distillation (SD)and supercritical CO2(SFE)method. The processes were optimized by an orthogonal test and the results were compared.Aninvitroantibacterial test and a para-DPPH-radical scavenging ability determination were conducted on the oil samples obtained. The results showed that the optimized extraction conditions for the SD method included substrate soaking for 8 h, a substrate:solvent ratio of 1∶6, and distillation for 7 h to get an oil yield of 0.186%.Whereas, those for the SFE method consisted of a processing pressure of 30 MPa and extract at 50℃ for 80 min to achieve an oil yield of 0.440%. The antibacterial and antioxidation properties of the volatile oil extracted by SFE were higher than those of the oil extracted by SD method. The bacteriostatic efficacies against various pathogens of the oils were in the order of:Bacillussubtilis>Staphyloccocusaureus>Escherichiacoli. The para-DPPH-radical scavenging ability of the oil extracted by SFE was the greatest, followed by that of SD and vitamin C. Both optimized processes were stable, however, the SFE method was considered more suitable for the extraction because its process cycle was shorter, oil yield higher,andantibacterial and antioxidant efficacies of the extracted volatile oil greaterthan the SD method.

Isodonexcia;volatile oil;extractionprocess;antibacterial; antioxidative

2016-03-12初稿；2016-04-14修改稿

王霞(1978-)，女，碩士，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)及天然產(chǎn)物分離(E-mail：wangxhangj@126.com)

長白山重點實驗室培育項目(吉農(nóng)院合字[2013]第s016 號)

R 284

A

1008-0384(2016)07-747-05

王霞，許菊香,于曉明，等.尾葉香茶菜揮發(fā)油的提取工藝及其抗菌和抗氧化作用[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，31(7)：747-751.

WANG X，XU J-X，YU X-M，et al.Extraction and Antibacterial and Antioxidative Properties of Volatile Oil fromIsodonexcia[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(7)：747-751.