田永杰，徐秀舉，陸益新，王超，周天祺，李湘鳴

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，揚(yáng)州225001

比較兩種RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的全酵母發(fā)光細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變?cè)脑u(píng)價(jià)效果

田永杰，徐秀舉，陸益新，王超，周天祺，李湘鳴*

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，揚(yáng)州225001

通過分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建2種不同RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的yEGFP重組報(bào)告載體pRAD54-yEGFP和pRAD54S-yEGFP，前者啟動(dòng)子DNA為1.8 kb，后者為0.5 kb，分別轉(zhuǎn)入W303-1A酵母細(xì)胞，構(gòu)建2種啟動(dòng)子調(diào)控的發(fā)光酵母細(xì)胞，用不同化學(xué)誘變?cè)饔煤螅昧魇郊?xì)胞儀和多功能發(fā)光儀測定酵母的發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種啟動(dòng)子調(diào)控的酵母細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度均與化學(xué)誘變?cè)?甲磺酸甲脂、4-硝基-N-氧化喹啉和5-氟尿嘧啶)有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但是W303-1A/RAD54-yEGFP劑量效應(yīng)關(guān)系較為明顯，產(chǎn)生的最大誘導(dǎo)倍數(shù)(5.96、2.19和2.71)明顯高于W303-1A/RAD54S-yEGFP所產(chǎn)生的最大誘導(dǎo)倍數(shù)(2.53、1.50和1.91)，可能與啟動(dòng)子序列中轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量以及轉(zhuǎn)錄因子間協(xié)同增效作用有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀測定效果明顯優(yōu)于發(fā)光儀測定效果。所以在構(gòu)建RAD54啟動(dòng)子調(diào)控重組酵母細(xì)胞篩選誘變時(shí)，選用全啟動(dòng)子序列效果較好。

化學(xué)誘變?cè)?；RAD54啟動(dòng)子；酵母細(xì)胞；綠色熒光蛋白；劑量效應(yīng)關(guān)系

田永杰,徐秀舉,陸益新,等.比較兩種RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的全酵母發(fā)光細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變?cè)脑u(píng)價(jià)效果[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):251-257

Tian Y J,Xu X J,Lu Y X,et al.The comparison of bioassay for chemical mutagens between the two RAD54 promoters regulating whole fluorescent yeast cells[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):251-257(in Chinese)

DNA毒性化合物(化學(xué)誘變物，簡稱誘變物)是指一大類可對(duì)生物大分子遺傳物質(zhì)產(chǎn)生毒性的化合物。這類化合物所造成的環(huán)境污染潛在性危害較大，因?yàn)槠涠鄶?shù)具有致癌性。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，新化學(xué)物在不斷的出現(xiàn)，需要評(píng)價(jià)致突變性的化學(xué)物數(shù)量劇增，但是現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的體外致突變實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)、成本高，遠(yuǎn)不能滿足需求，迫切需要發(fā)展快速的高通量方法。因此，建立高效、快速、自動(dòng)化、敏感、相對(duì)可靠、高通量地篩選這類化合物的評(píng)價(jià)方法，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

釀酒酵母細(xì)胞的RAD54基因位于第七號(hào)染色體上，編碼區(qū)全長約3 613 bp，開放性閱讀框(ORF)為2 694 bp[1]，通過對(duì)GenBank中RAD54基因組的檢索發(fā)現(xiàn)RAD54基因的上游是SUT1基因，下游是YRB30基因，在RAD54基因和SUT1基因之間分別是兩者的啟動(dòng)區(qū)，大小約1.8 kb。RAD54蛋白是致DNA斷裂誘變?cè)T導(dǎo)的一種特異性表達(dá)的酵母蛋白，對(duì)該基因突變會(huì)使細(xì)胞對(duì)X-射線等致DNA斷裂誘變?cè)拿舾行源蟠笤黾?。有學(xué)者認(rèn)為該基因與DNA的損傷后的同源重組修復(fù)有關(guān)，因?yàn)樵S多化學(xué)誘變?cè)鶗?huì)誘導(dǎo)酵母細(xì)胞RAD54基因高效表達(dá)[2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)化學(xué)誘變?cè)饔糜诮湍讣?xì)胞造成雙股DNA斷裂時(shí)，會(huì)使許多有關(guān)DNA修復(fù)基因的表達(dá)量大大增加[3]。因此，許多學(xué)者利用分子生物學(xué)技術(shù)，將RAD54啟動(dòng)子與報(bào)告基因相融合，構(gòu)建成重組酵母細(xì)胞，用于高通量篩選化學(xué)誘變?cè)璠4-6]。但是，由于RAD54基因的啟動(dòng)子范圍目前仍然沒有完全研究清楚，在構(gòu)建重組酵母細(xì)胞，用于快速高通量篩選化學(xué)誘變?cè)?，所選用的啟動(dòng)區(qū)范圍均不相同。有的選用RAD54基因和SUT1基因之間的全部序列作為啟動(dòng)子[7-9]；有的則選用-500 bp以下的DNA序列作為啟動(dòng)子[10-11]。啟動(dòng)子不同對(duì)化學(xué)誘變?cè)暮Y選敏感性則不同。兩者何者用于對(duì)化學(xué)誘變?cè)暮Y選效果較好，目前國內(nèi)外未見報(bào)道。因此，研究比較2種啟動(dòng)子對(duì)化學(xué)誘變?cè)Y選的敏感性，對(duì)選用何種重組酵母細(xì)胞對(duì)化學(xué)誘變進(jìn)行篩選，具有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 材料

質(zhì)粒pLZ-yEGFP，大腸桿菌DH5α，酵母W303-1A(基因型:MATα，leu 2-3，112 ura3-1，trp1-1，his3-11，15 ade2-1)由本實(shí)驗(yàn)室保存(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室)；限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購自TaKaRa公司；所用質(zhì)粒提取試劑盒和純化試劑盒來自AxyGen公司；用普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；倒置熒光顯微鏡(尼康Ti-U)由日本Nikon公司生產(chǎn)；多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek Synergy2)由美國伯騰公司生產(chǎn)；引物由中科華大博科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RAD54全啟動(dòng)子調(diào)控的yEGFP報(bào)告載體的構(gòu)建

1.2.1.1 RAD54全啟動(dòng)子克隆

根據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法提取酵母基因組，根據(jù)GenBank所報(bào)道的RAD54啟動(dòng)子序列以酵母基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增RAD54啟動(dòng)子。由于RAD54啟動(dòng)子較長，加之在(242 bp和1 393 bp)處有Hind III酶切位點(diǎn)，故采用分段的方法擴(kuò)增RAD54啟動(dòng)子。首先擴(kuò)增上1/2片段，引物設(shè)計(jì)為上游5′-AAAAAGCTT GAAGTTTAGATGAGTAAGGAA-3′，下游為5′-TAGGGATCCTAATACGGTATAACGTAAACC-3′，引物兩端分別增設(shè)3個(gè)保護(hù)堿基及Hind III和BamH I兩酶切位點(diǎn)(下劃線所示)；RAD54啟動(dòng)子下1/2片段引物設(shè)計(jì)為上游5′-TTAGGATCCCTATAAGGGTTCCTTCGGGAGGA-3′，下游5′-TCTACCGGTCAGTTATAAGGAAATATATATG-3′，引物兩端分別增設(shè)BamH I和Age I兩酶切位點(diǎn)(下劃線所示)和保護(hù)堿基。

上1/2片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA試劑盒回收純化后，與pLZ-yEGFP一并用Hind III和BamH I酶切，將其與載體pLZ-yEGFP用T4連接酶相連，將所構(gòu)建的載體命名為pRAD54-1-yEGFP；下1/2片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，與pRAD54-1-yEGFP一并用BamH I和Age I進(jìn)行雙切，并用T4連接酶相連，從而構(gòu)建成RAD54全啟動(dòng)子調(diào)控的yEGFP酵母報(bào)告載體，將其命名為pRAD54-yEGFP(見圖1)。

圖1 pRAD54-yEGFP酵母報(bào)告載體

1.2.1.2 -500 bp RAD54啟動(dòng)子的克隆

劃線接種pRAD54-yEGFP菌液于LB/AMP平板，37℃培養(yǎng)18～20 h。再挑取單克隆于5～6 mL的LB/AMP培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，用Axy-Gen試劑盒提取質(zhì)粒，將pRAD54-yEGFP載體用Hind III進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳分析，用DNA純化試劑盒切膠回收載體片段。經(jīng)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)DH5α，用LB/ Amp平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子克隆于LB/Amp培養(yǎng)液中，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，測序，將所構(gòu)建載體命名為pRAD54S-yEGFP(見圖2)。

圖2 pRAD54S-yEGFP酵母報(bào)告載體

1.2.2 RAD54和RAD54S啟動(dòng)子調(diào)控的重組yEGFP酵母細(xì)胞的建立

用醋酸鋰方法分別將pRAD54-yEGFP和pRAD54S-yEGFP轉(zhuǎn)化于感受態(tài)酵母細(xì)胞W303-1A，用SD/-ura選擇性培養(yǎng)板篩選陽性克隆。提取酵母DNA，對(duì)重組酵母細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定，引物分別選用yEGFP的上下游引物。在所挑取4個(gè)轉(zhuǎn)化子克隆中發(fā)現(xiàn)有3個(gè)克隆中有yEGFP目的基因(約700 bp)(圖片省略)。說明RAD54和RAD54S啟動(dòng)子調(diào)控的重組yEGFP發(fā)光酵母細(xì)胞的構(gòu)建成功。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)研究

根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道化學(xué)誘變?cè)饔米罴褧r(shí)間為10～16 h，故用以下不同DNA作用水平的誘變?cè)瓕?duì)細(xì)胞作用12 h，進(jìn)行劑量效應(yīng)研究。

(1)使DNA發(fā)生烷基化的誘變?cè)杭谆撬峒字?methylmethanesulfonate,MMS)，其終濃度為400、200、100、25、6.25、1.56和0 μg·mL-1。(2)使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)?-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-noxide,4-NQO)，其終濃度為5、1.25、0.32、0.08、0.04、0.02和0 μg·mL-1。(3)抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)?-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-F)，其終濃度為500、250、62.5、16、4、1和0 μg·L-1。(4)非基因毒性物質(zhì)：秋水仙堿(colchicine)，其終濃度為250、125、62.5、31、16、4和0 μg·L-1。刀豆氨酸(canavanine)和四環(huán)素(tetracycline)，其終濃度分別為100、50、25、6.25、1.6、0.4和0 μg·mL-1。以上各劑量組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照(0)均選用各自化學(xué)物的溶劑。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

用Excel軟件對(duì)資料進(jìn)行分析處理。多功能發(fā)光儀所測發(fā)光度用相對(duì)發(fā)光度表示(發(fā)光強(qiáng)度/ OD600)；流式細(xì)胞儀測定10 000個(gè)細(xì)胞的平均發(fā)光強(qiáng)度[16]；各劑量組復(fù)孔結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；用誘導(dǎo)倍數(shù)描述劑量效應(yīng)關(guān)系；誘導(dǎo)倍數(shù)為受試物濃度組所產(chǎn)生的發(fā)光度與空白對(duì)照發(fā)光度之比，其超過1.5倍并存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，可判斷受試物為陽性[17]。

2 結(jié)果（Results）

2.1 熒光顯微鏡下觀察

圖3為2種不同RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的重組酵母細(xì)胞經(jīng)過MMS的誘導(dǎo)后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，2種細(xì)胞均發(fā)出清晰、耀眼的熒光，呈散狀分布，與對(duì)照明顯不同。但是，在相同的放大倍數(shù)和相同的激發(fā)波長下，肉眼不能發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量和亮度有明顯差異。

圖3 在熒光顯微鏡下觀察重組酵母細(xì)胞W303-1A/RAD54-yEGFP和W303-1A/RADS54-yEGFP

圖4 MMS誘導(dǎo)濃度和重組酵母細(xì)胞發(fā)光度的劑量效應(yīng)關(guān)系

2.2 DNA烷基化誘變?cè)脑u(píng)價(jià)

選用MMS作為這類化學(xué)物的代表。圖4可見W303-1A/RAD54-yEGFP和W303-1A/RAD54S-yEGFP酵母細(xì)胞經(jīng)MMS作用12 h后，細(xì)胞的發(fā)光度與MMS均有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，并在200 μg· mL-1時(shí)效應(yīng)達(dá)高峰。W303-1A/RAD54-yEGFP劑量效應(yīng)較明顯關(guān)系，最大誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)5.96，而W303-1A/RAD54S-yEGFP最大誘導(dǎo)倍數(shù)為2.53。同時(shí)也可看到，流式細(xì)胞儀測定方法的敏感性優(yōu)于發(fā)光儀。

2.3 DNA發(fā)生斷裂誘變?cè)脑u(píng)價(jià)

圖5為使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)?-NQO與2種RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的yEGFP酵母細(xì)胞的劑量效應(yīng)關(guān)系，從流式細(xì)胞儀所測結(jié)果來看，W303-1A/ RAD54-yEGFP與4NQO有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，在0.04 μg·mL-1以上濃度組，誘導(dǎo)倍數(shù)均超過1.5，最高為2.19，而W303-1A/RAD54S-yEGFP雖然亦有劑量效應(yīng)關(guān)系，但不及前者明顯，最大誘導(dǎo)倍數(shù)僅為1.78。從用發(fā)光儀檢測結(jié)果來看，W303-1A/RAD54-yEGFP在0.32 μg·mL-1以上組有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，最大誘導(dǎo)倍數(shù)為1.74；雖然W303-1A/RAD54S-yEGFP在0.32 μg·mL-1以上濃度組誘導(dǎo)倍數(shù)明顯升高，但是，由于細(xì)胞毒性的原因，其OD 600和yEGFP發(fā)光度已降至本底水平，分別為0.138和740，所以這種升高實(shí)際上是細(xì)胞毒性所致。

圖5 4-硝基-N-氧化喹啉（4NQO）濃度和重組酵母細(xì)胞發(fā)光度的劑量效應(yīng)關(guān)系

圖6 5氟尿嘧啶誘導(dǎo)濃度和重組酵母細(xì)胞發(fā)光度的劑量效應(yīng)關(guān)系

2.4 抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶誘變?cè)脑u(píng)價(jià)

圖6所示為抑制DNA合成酶誘變?cè)?-F對(duì)2種RAD54啟動(dòng)子調(diào)控的發(fā)光酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見經(jīng)12 h作用后，經(jīng)流式細(xì)胞儀和發(fā)光儀測定，發(fā)現(xiàn)W303-1A/RAD54-yEGFP與5-F有劑量效應(yīng)關(guān)系，最大誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.53和2.71，而W303-1A/RAD54S-yEGFP經(jīng)用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)有劑量效應(yīng)關(guān)系，最高誘導(dǎo)倍數(shù)為1.91，但是，在用發(fā)光儀檢測時(shí)，未發(fā)現(xiàn)有劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.5 非基因毒性化學(xué)物的評(píng)價(jià)

選用秋水仙堿、刀豆氨酸和四環(huán)素對(duì)細(xì)胞有毒性的非基因毒性化合物進(jìn)行特異性研究，經(jīng)用流式細(xì)胞儀和發(fā)光儀檢測，以及熒光顯微鏡觀察，均未發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞的發(fā)光度與對(duì)照有明顯的差別(資料省略)，說明兩者均有較好的特異性。

3 討論（Discussion）

當(dāng)化學(xué)物使DNA損傷或合成阻斷時(shí)，可同時(shí)誘導(dǎo)多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以提高細(xì)胞的修復(fù)能力。RAD54編碼涉及發(fā)生DNA重組損傷修復(fù)的ATP酶，當(dāng)外來誘變物使DNA發(fā)生重組后，RAD54可大量表達(dá)[18]。因此，國外許多學(xué)者將RAD54啟動(dòng)子與某些報(bào)告基因相融合，構(gòu)建成重組酵母細(xì)胞，用于快速、高通量篩選化學(xué)誘變?cè)?，但是，所選啟動(dòng)子的大小卻不盡相同。Cole等[8]將RAD54閱讀框上游406 pb堿基(-406 bp)與Lac Z報(bào)告基因相融合，發(fā)現(xiàn)Lac Z基因的表達(dá)量，與DNA的損傷有關(guān)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在-406 bp內(nèi)有一29 bp的DNA損傷調(diào)控序列(Damage Regulatory Sequence,DRS)，對(duì)化學(xué)誘變?cè)姆磻?yīng)起著至關(guān)重要的作用，它的缺失將會(huì)失去對(duì)誘變?cè)捻憫?yīng)。所以，有些學(xué)者為了克隆方便，多選用-500 bp以內(nèi)含有DRS的DNA序列作為啟動(dòng)子[2,10,19]。但是，也有學(xué)者選用RAD54開放性閱讀框(ORF)上游和SUT1基因之間的全部序列(-1.8 kb區(qū))作為啟動(dòng)子[8-9,20]。因此，比較2種啟動(dòng)子的敏感性，對(duì)指導(dǎo)誘變?cè)暮Y選具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

啟動(dòng)子是指一段能被RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合，能正確有效地起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA調(diào)控序列，一般位于基因5’端上游區(qū)域。在真核類基因的轉(zhuǎn)錄起始階段，激活轉(zhuǎn)錄因子與基因上游的調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合從而激活基因的轉(zhuǎn)錄。在真核基因的表達(dá)調(diào)控中，多數(shù)真核基因具有2個(gè)或2個(gè)以上的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)，單個(gè)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活效率最低，多個(gè)調(diào)控位點(diǎn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄具有協(xié)同性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)-1.8 kb區(qū)啟動(dòng)子所構(gòu)建的重組酵母細(xì)胞，對(duì)誘變?cè)拿舾行悦黠@優(yōu)于-500 bp所調(diào)控的酵母細(xì)胞。這是因?yàn)榻湍父哳l轉(zhuǎn)錄基因的內(nèi)含子中存在一些可能的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控位點(diǎn)，如在RAD54啟動(dòng)子中有數(shù)個(gè)正向轉(zhuǎn)錄因子(ABF1 12個(gè)，TAF 11個(gè)，GCN4 4個(gè)，ADR1 2個(gè)，REB1 1個(gè))，而RAD54S中正向轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)較少(ABF1 4個(gè)，TAF 3個(gè)，GCN4 1個(gè))。2種啟動(dòng)子所調(diào)控的重組酵母細(xì)胞在對(duì)化學(xué)誘變?cè)脑u(píng)價(jià)敏感度上的差異這可能與正向轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量以及轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同增效作用有關(guān)[22-23]。

對(duì)誘變?cè)暮Y選敏感性除了與啟動(dòng)子的選擇有關(guān)外，還與所使用的方法或儀器有關(guān)。發(fā)現(xiàn)用流式細(xì)胞儀的敏感性優(yōu)于發(fā)光儀，這主要是流式細(xì)胞儀可以定量地觀察一定細(xì)胞數(shù)量的發(fā)光強(qiáng)度，而發(fā)光儀所測的發(fā)光強(qiáng)度，受到細(xì)胞數(shù)量不同的影響，需要用OD 600進(jìn)行校正[24]，而當(dāng)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性較大時(shí)，會(huì)使OD 600低于0.300以下，從而造成較大的誤差(如圖5)，因?yàn)椋琌D 600在大于0.300以上時(shí)，才能較好反映細(xì)胞的數(shù)量。

雖然用yEGFP作為報(bào)告基因有許多優(yōu)點(diǎn)，但是，其發(fā)射峰位于培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)器材及細(xì)胞成分等產(chǎn)生的熒光背景范圍之內(nèi)，許多凋亡的細(xì)胞也可產(chǎn)生熒光，故具有較高的“背景噪聲”，所以，在進(jìn)行熒光定量研究時(shí)，最好與倒置熒光顯微鏡結(jié)合起來，但是，用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行定性效果較好，因?yàn)椋R下所觀察的發(fā)光強(qiáng)度通常受激發(fā)光的強(qiáng)度、曝光時(shí)間、放大倍數(shù)等因素的影響。

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Oxidative Damage and Cell Cycle Arrest in Rat C6 Astroglial Cells Induced by Tri-ortho-cresyl Phosphate

Tian Yongjie,Xu Xiuju,Lu Yixin,Wang Chao,Zhou Tianqi,Li Xiangming*

Preventive Medicine Department,Yangzhou Medical College,Yangzhou University,Yangzhou 225001,China

13 November 2015 accepted 4 May 2016

Two yEGFP yeast reporter vectors,pRAD54-yEGFP and pRAD54S-yEGFP,regulated by two RAD54 promoters,were constructed by a molecular biological technique.The DNA lengths of the two promoters are 1.8 and 0.5 kb.These two vectors were transformed into W301-A yeast cells to construct the whole fluorescent yeast cells regulated by the two RAD54 promoters,which were named as W303-1A/RAD54-yEGFP and W303-1A/ RAD54S-yEGFP.After that,the whole yeast cells were treated by different chemical mutagens(methylmethanesulfonate,4-nitroquinoline-noxide and 5-fluorouracil)and their fluorescent densities were measured on a flow cytometer and a multifunctional luminous instrument.The fluorescent densities from the two types of yeast cells both exhibit significant dose effect relationships with methylmethanesulfonate,4-nitroquinoline-noxide and 5-fluorouracil concentration.The dose effect relationships of W303-1A/RAD54-yEGFP are more obvious.The maximum fold ofinduction of W303-1A/RAD54-yEGFP are 5.96,2.19 and 2.71,while those of W303-1A/RAD54S-yEGFP are 2.53,1.50 and 1.91.Such differences may be related to the number and synergy of transcription factors.Meanwhile,the results from flow cytometry are more sensitive than that of the multifunctional luminous instrument. When constructing a recombinant yeast cell regulated by RAD54 promoter for screening mutagens,it is suggested to choose the whole sequence of the RAD54 promoter.

chemical mutagen;RAD54 promoter;yeast cell;yEGFP;dose effect relationship

2015-11-13 錄用日期：2016-05-04

1673-5897（2016）3-251-07

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151113003

簡介：李湘鳴(1957-)，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)楝F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

國家自然科學(xué)基金(81041111)

田永杰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿佣纠韺W(xué)，E-mail:354097170@qq.com；

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:847264344@qq.com