高上吉，鐘曉霞，劉婉瑩，王勉之，孫靜，李弘程，孫永學(xué)

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642

基于彗星實(shí)驗(yàn)的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的研究

高上吉，鐘曉霞，劉婉瑩，王勉之，孫靜，李弘程，孫永學(xué)*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642

為評價(jià)洛克沙胂的遺傳毒性，采用單細(xì)胞凝膠電泳(彗星實(shí)驗(yàn))，研究了不同濃度的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞脫氧核醣核酸(DNA)的損傷作用。提取秀麗隱桿線蟲的胚胎細(xì)胞，分別暴露于0(空白對照)、50、250、500 μg·L-1含洛克沙胂的溶液染毒1 h。用彗尾DNA百分比含量(TDNA%)、彗星尾長(TL)和Olive尾矩(OTM)作為DNA損傷的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照組比較，處理組中彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩顯著增加(P<0.01)。隨著洛克沙胂濃度的增加，彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩逐漸增加，其相關(guān)系數(shù)r>0.99，說明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，存在極顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA具有損傷作用，彗星實(shí)驗(yàn)操作簡便、快速、靈敏度高，能夠反映出洛克沙胂的遺傳毒性。因此，通過彗星實(shí)驗(yàn)建立實(shí)驗(yàn)室檢測洛克沙胂遺傳毒性的方法具有可行性。

洛克沙胂；秀麗隱桿線蟲；彗星實(shí)驗(yàn)；DNA損傷；遺傳毒性

高上吉,鐘曉霞,劉婉瑩,等.基于彗星實(shí)驗(yàn)的洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的研究[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016,11(3):167-172

Gao S J,Zhong X X,Liu W Y,et al.Comet assay study on DNA damage of embryonic cells inCaenorhabditis elegansinduced by roxarsone[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):167-172(in Chinese)

洛克沙胂(roxarsone)是一種有機(jī)砷類飼料添加劑，具有明顯的促進(jìn)動物生長及抗菌、抗球蟲的作用，在我國被廣泛應(yīng)用。畜禽飼喂洛克沙胂后吸收較少，大部分以原形隨糞便和尿液直接排泄到體外，所吸收的很少部分也會經(jīng)機(jī)體代謝后排泄到體外[1]。獸藥隨動物糞、尿等排泄物進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，污染環(huán)境土壤、表層水體等，并通過食物鏈影響植物、動物和微生物的正常生命活動，或在植物中富集，最終將影響人類的健康[2-3]。

然而，洛克沙胂潛在的遺傳毒性尚不可知，特別是對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)損傷的研究資料尚為空白。彗星實(shí)驗(yàn)(單細(xì)胞凝膠電泳，SCGE)是測定單個(gè)細(xì)胞DNA斷裂的技術(shù)，近年來，因其快速、敏感、經(jīng)濟(jì)和靈敏度高等特點(diǎn)已在環(huán)境污染物的遺傳毒性評價(jià)方面得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。秀麗隱桿線蟲因其個(gè)體結(jié)構(gòu)簡單、易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、生活史短等許多優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6]。本實(shí)驗(yàn)采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)探討了洛克沙胂暴露脅迫對秀麗隱桿線蟲體外培養(yǎng)胚胎細(xì)胞DNA的損傷作用，為評價(jià)洛克沙胂的遺傳毒性提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 主要儀器設(shè)備

水平電泳儀(Power Pac Basic，基本型電源，美國Bio-Rad公司)；水平電泳槽(SPFT型，美國Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(DM2500，德國Leica公司)；冷凍離心機(jī)(Sorvall RC 12BP，美國Thermo公司)；電子分析天平(感量0.00001 g，AE160，瑞士Mettler公司)；電子分析天平(0.001 g，Sartorius BSA323S，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；超純水機(jī)(Milli-Q，美國Millipole公司)；可調(diào)微量移液器(Eppendorf Research型，0.5～2.5 μL，2～20 μL，10～100 μL，20～ 200 μL，100～1 000 μL，500～5 000 μL，德國Eppendorf公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

洛克沙胂原料藥粉(含量98.5%，廣州惠華動物保健品有限公司提供)；正常熔點(diǎn)瓊脂糖(NMA，美國Sigma公司)；低熔點(diǎn)瓊脂糖(LMA，美國Sigma公司)；曲拉通X-100(Triton X-100，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；N-十二烷基肌氨酸鈉(SLS，美國Sigma公司)；溴化乙錠(EB，美國Sigma公司)；Tris-Base(美國Genview公司)；臺酚藍(lán)(美國Genview公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 線蟲和菌株

野生型秀麗隱桿線蟲(N2)以及大腸桿菌OP50 (E.coliOP50)均由國際線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)獲得。線蟲生長培養(yǎng)基(Nematode Growth Medium，NGM)：氯化鈉3 g，瓊脂粉17 g，加雙蒸水至1 L，高壓滅菌40 min后，55℃水浴15 min加入1 mol·L-1無菌氯化鈣溶液1 mL，1 mol· L-1無菌硫酸鎂1 mL，1 mol·L-1無菌磷酸鉀緩沖液(pH=6)25 mL，5 mg·mL-1無菌膽固醇乙醇溶液1 mL，混勻后倒入培養(yǎng)皿，待凝固后鋪上大腸桿菌OP50菌液，于20℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)[7]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

當(dāng)大部分秀麗隱桿線蟲成蟲到達(dá)產(chǎn)卵初期，用15 mL離心管收集洗滌后的成蟲，以750×g離心1 min，棄去上清液，加入漂白液5 mL(新鮮5%次氯酸鈉溶液1 mL、5 mol·L-1NaOH溶液0.5 mL、雙蒸水3.5 mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)；漩渦振蕩3～5 min至大部分成蟲裂解，使成蟲體內(nèi)的蟲卵釋放；加入蟲卵緩沖液(含118 mmol·L-1的NaCl、48 mmol·L-1的KCl、2 mmol·L-1的CaCl2、2 mmol·L-1的MgCl2，25 mmol· L-1的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，過濾除菌)，以1 500×g離心1 min，棄去上清液，相同條件洗滌3次后，棄去上清液，保留1 mL的液體；加入1 mL 60%蔗糖溶液，混勻，使蟲卵懸浮于30%的蔗糖溶液，以1 500× g離心5 min，收集上清液中的蟲卵。用蟲卵緩沖液洗去蔗糖，收集蟲卵并加入含1 U·mL-1幾丁質(zhì)酶的蟲卵緩沖液(過濾除菌)1 mL，于室溫下消化約45 min，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)約90%的蟲卵卵殼被溶解后，置于EP管中于4℃、以900×g離心4 min，棄去上清液，加入1 mL的L-15培養(yǎng)基將管底沉淀的細(xì)胞混勻后900×g離心4 min，棄去上清液，加入1 mL的L-15培養(yǎng)基，混勻；用5 μm濾器過濾懸浮液至無菌EP管，獲取離散的秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞。將EP管于4℃、以900×g離心4 min，棄去上清液，用預(yù)先配制好的加有雙抗(50 U·mL-1青霉素、50 μg·mL-1鏈霉素)和10%胎牛血清的L-15完全培養(yǎng)基混勻胚胎細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約1.5×106個(gè)·mL-1，備用。6孔板中預(yù)先放置一塊用多聚左旋賴氨酸包被并滅菌的蓋玻片，取100 μL細(xì)胞懸液滴加到蓋玻片中央，于20℃孵育2 h后再加入2 mL完全培養(yǎng)基，于20℃靜置4 h，至此胚胎細(xì)胞懸浮液制作完成[8-9]。

吸取50 μL蟲卵懸浮液與50 μL臺酚藍(lán)染色液于離心管中混合均勻，取少許混合液(約15 μL)白血球計(jì)數(shù)板上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞顯藍(lán)色，計(jì)數(shù)100～200個(gè)細(xì)胞，經(jīng)檢查所有處理組細(xì)胞成活率均大于90%，滿足彗星實(shí)驗(yàn)細(xì)胞成活率至少大于75%的要求[10-11]。

1.5 胚胎細(xì)胞的染毒

將洛克沙胂溶解于雙蒸水中，使質(zhì)量濃度(以As計(jì))分別達(dá)到100、500、1 000 μg·L-1，以雙蒸水作空白對照。胚胎細(xì)胞成活率檢測后，小心吸出液體培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和死細(xì)胞，取100 μL的液體培養(yǎng)基，加入配好洛克沙胂溶液100 μL，使染毒終濃度分別為50、250、500 μg·L-1洛克沙胂溶液，染毒1 h，并設(shè)置空白對照。以上操作均在黑暗條件下進(jìn)行，且洛克沙胂溶液在使用前配制。

1.6 彗星實(shí)驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)參照Singh等[12]、王瑞國[13]的方法略加改進(jìn)。每張玻片用熒光顯微鏡放大400倍拍照，每組至少隨機(jī)選擇50個(gè)不重疊的彗星影像進(jìn)行拍照。每個(gè)處理組至少隨機(jī)選擇150個(gè)彗星圖像采用CASP軟件進(jìn)行分析，以彗尾DNA百分比含量(TDNA%)、彗星尾長(TL)和Olive尾矩(OTM)[14-15]作為DNA損傷的評價(jià)指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件(16.0版，SPSS Inc.)。不同處理組間差異采用單因子方差分析(One-way ANOVA)，不同處理組間差異顯著性采用Duncan檢驗(yàn)(0.01

2 結(jié)果與分析（Results and analysis）

2.1 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞成活率的影響

由圖1可知，空白對照組和各洛克沙胂染毒組線蟲胚胎細(xì)胞成活率均大于90%，說明胚胎細(xì)胞DNA損傷為洛克沙胂作用所致，而非細(xì)胞毒性。

圖1 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞成活率的影響

圖2 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像

2.2 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA的損傷及彗星圖像分析

空白對照組和各洛克沙胂染毒組彗星圖像如圖2所示。由圖2可見，空白對照組的胚胎細(xì)胞DNA完整，細(xì)胞核大小均一，呈圓形熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣光滑，彗星細(xì)胞無拖尾現(xiàn)象，DNA沒有明顯的損傷(圖2A)。50 μg·L-1洛克沙胂暴露濃度組胚胎細(xì)胞核中心呈一熒光紅點(diǎn)，周圍有一層“紅暈”，說明細(xì)胞DNA開始出現(xiàn)解體，呈松散狀態(tài)，彗星細(xì)胞開始出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象(圖2B)。250、500 μg·L-1洛克沙胂暴露濃度組胚胎細(xì)胞DNA受損比較嚴(yán)重，均有一個(gè)像彗星一樣的拖尾，呈掃帚狀，類似彗星，并且隨著洛克沙胂濃度的增加，細(xì)胞核逐漸縮小，彗星尾長逐漸延長，尾部熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小(圖2C、D)，其損傷作用表現(xiàn)出顯著的濃度效應(yīng)。圖3是經(jīng)CASP彗星圖象分析軟件分析后，由于熒光強(qiáng)度的不同而顯示出彗頭和彗尾的清晰輪廓。

圖3 CASP彗星圖像分析

2.3 洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的影響及濃度-效應(yīng)關(guān)系

不同濃度洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的影響效應(yīng)如表1所示。各濃度組彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩均極顯著高于空白對照組(P<0.01)，且各濃度組彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩之間均有極顯著性差異(P<0.01)。彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩隨著洛克沙胂暴露濃度的增加而增高，彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩與洛克沙胂暴露濃度均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系(r= 0.991，P<0.01；r=0.993，P<0.01；r=0.991，P<0.01)。

3 討論（Discussion）

線蟲是土壤動物區(qū)系中最為豐富的無脊椎動物，它們參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、植物營養(yǎng)礦化和養(yǎng)分循環(huán)等重要生態(tài)過程，在土壤生態(tài)系統(tǒng)腐屑食物網(wǎng)中占有重要地位[16-17]。線蟲因其形態(tài)特殊性、食物專一性、分離鑒定相對簡單，以及對環(huán)境的各種變化包括污染脅迫效應(yīng)能做出較迅速的反應(yīng)等特點(diǎn)，可將線蟲作為土壤污染效應(yīng)研究的生物指標(biāo)。彗星實(shí)驗(yàn)通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度可定量測定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷的程度[18]，因其簡便、快速、應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、所需細(xì)胞少而成為科研工作者進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查以及生態(tài)毒理學(xué)研究的有效工具，是檢測細(xì)胞遺傳毒性的常用方法。

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，受損胚胎細(xì)胞的尾部DNA百分比含量以及彗星尾長與DNA損傷程度有關(guān)，故尾部DNA百分比含量以及彗星尾長是評價(jià)DNA損傷的重要參數(shù)，而Olive尾矩指標(biāo)作為復(fù)合值，較單一的尾部DNA百分比含量以及彗星尾長指標(biāo)有更高的準(zhǔn)確性。本研究采用CASP軟件分析彗星圖像，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確，避免了人為誤差[19]；而且OTM指標(biāo)分析靈敏，結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行對比分析將進(jìn)一步提高SCGE技術(shù)的準(zhǔn)確性和靈敏度。

表1 不同濃度洛克沙胂暴露1 h對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=150）Table 1 Results of DNA damage of embryonic cells inCaenorhabditis elegansinduced by different concentrations of roxarsone exposure for 1 h(mean±standard deviation,n=150)

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度洛克沙胂暴露后，秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞彗尾DNA百分比含量、彗星尾長以及Olive尾矩均極顯著增加，DNA損傷均極顯著增加。研究表明，洛克沙胂暴露下會使抗氧化酶活性受到抑制，導(dǎo)致過量活性氧自由基的產(chǎn)生。劉耀川等[20]發(fā)現(xiàn)洛克沙胂引起大鼠肝臟和肺臟抗氧化酶(超氧化物歧化酶)活性顯著下降，孫永學(xué)[21]發(fā)現(xiàn)洛克沙胂可導(dǎo)致大白鼠肝勻漿和血清以及鯽魚腦抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)活性的減弱，引起抗氧化物質(zhì)(還原型谷胱甘肽)減少，而氧化產(chǎn)物(如丙二醛)增高。細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生大量的自由基，可被體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)所清除同時(shí)，對活性氧自由基的清除能力減弱會導(dǎo)致過量活性氧自由基產(chǎn)生。這些自由基超過一定限度時(shí)，可分別與分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生氧化性損傷和生成加合物，最終導(dǎo)致DNA鏈斷裂和損傷[22-23]，這可能是洛克沙胂遺傳毒性的機(jī)制。

洛克沙胂對核酸物質(zhì)具有較強(qiáng)的毒性，能導(dǎo)致DNA鏈斷裂。通過相關(guān)性分析得知，洛克沙胂對秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)呈很好的相關(guān)性，洛克沙胂的濃度與DNA損傷存在極顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)>0.99，因此，秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷可作為洛克沙胂遺傳毒性的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，洛克沙胂的濃度與DNA損傷存在極顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，洛克沙胂可導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA明顯的斷裂和遷移，誘導(dǎo)了秀麗隱桿線蟲的遺傳損傷，秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷可作為洛克沙胂遺傳毒性的生物學(xué)指標(biāo)。

目前關(guān)于洛克沙胂的環(huán)境影響的研究僅僅是初步的。為評價(jià)和控制洛克沙胂對環(huán)境的影響，還有很多工作要做。彗星實(shí)驗(yàn)操作簡便、快速、靈敏度高，能夠反映出洛克沙胂的遺傳毒性。因此，通過彗星實(shí)驗(yàn)建立實(shí)驗(yàn)室檢測洛克沙胂遺傳毒性方法具有可行性。洛克沙胂導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲胚胎細(xì)胞DNA損傷的損傷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Comet Assay Study on DNA Damage of Embryonic Cells in Caenorhabditis elegans Induced by Roxarsone

Gao Shangji,Zhong Xiaoxia,Liu Wanying,Wang Mianzhi,Sun Jing,Li Hongcheng,Sun Yongxue*

Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Development and Safety Evaluation,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China

30 December 2015 accepted 14 March 2016

To evaluate the genotoxicity of roxarsone,the present study investigated the damage effects of different concentrations of roxarsone on deoxyribonucleic acid(DNA)of embryonic cells inCaenorhabditis elegansby using the single cell gel-electrophoresis(SCGE).The extracted embryonic cells ofCaenorhabditis eleganswere exposed to 0(blank control),50,250,500 μg·L-1roxarsone for 1 h,respectively.The percentage of comet tail DNA(TDNA%),the comet tail length(TL)and Olive tail moment(OTM)were used as the indicators of DNA damage.The results showed that,TDNA percentage,TL and OTM in all treatment groups increased significantly compared with these in the control group(P<0.01).TDNA percentage,TL and OTM increased gradually according to the increased concentrations of roxarsone.The correlation coefficient ofrgreater than 0.99,which indicated that the con-centration-effect relationship was observed in the experimental concentration range.Roxarsone had damage effect on DNA of embryonic cells inCaenorhabditis elegans.Comet assay was simple,fast,and highly-sensitive to reflect the genotoxicity of roxarsone.Thus,as a laboratory based method,it is practical to detect the genotoxicity of roxarsone by using comet assay.

roxarsone;Caenorhabditis elegans;comet assay;DNA damage;genotoxicity

2015-12-30 錄用日期：2016-03-14

1673-5897（2016）3-167-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151230001

簡介：孫永學(xué)(1969—)，男，博士，教授，研究方向?yàn)楂F藥安全性評價(jià)、生態(tài)毒理學(xué)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172368)

高上吉(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)，E-mail:710648618@qq.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:sunyx@scau.edu.cn