王玉婷，于紅霞，張效偉，史薇

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京210023

基于毒性效應(yīng)的間隙水致毒物質(zhì)鑒別技術(shù)進(jìn)展

王玉婷，于紅霞，張效偉，史薇*

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京210023

沉積物作為污染物遷移轉(zhuǎn)化過程中重要的“源”和“匯”，與整個生態(tài)系統(tǒng)及人類健康有著密切聯(lián)系。間隙水很大程度上反映了水體沉積物的污染狀況，同時可以真實反映生物的實際暴露情況，間隙水中關(guān)鍵致毒物質(zhì)的鑒別是科學(xué)準(zhǔn)確地評價間隙水及沉積物毒性與風(fēng)險的重要基礎(chǔ)。毒性鑒別評估(Toxicity Identification Evaluation,TIE)和效應(yīng)引導(dǎo)的污染物識別(Effect Directed Analysis,EDA)技術(shù)作為致毒物質(zhì)識別的主要方法，已在沉積物和間隙水的致毒物篩選中得到了初步的應(yīng)用。本文介紹并比較了常用的間隙水提取方法，總結(jié)了TIE和EDA在間隙水致毒物質(zhì)異位及原位鑒別方面的應(yīng)用與發(fā)展，及鑒別過程中使用到的基本毒性量化方法與其適用條件。在當(dāng)前間隙水關(guān)鍵致毒物質(zhì)識別研究的基礎(chǔ)上，指出了異位分析難以避免毒性損失和有機(jī)污染物鑒別方面的局限等問題，并提出應(yīng)推廣原位毒性試驗技術(shù)且進(jìn)一步發(fā)展有機(jī)物的精細(xì)分離技術(shù)和質(zhì)譜識別技術(shù)等發(fā)展方向。

間隙水；關(guān)鍵致毒物；毒性鑒別評估；效應(yīng)引導(dǎo)的污染物識別；原位

王玉婷,于紅霞,張效偉,等.基于毒性效應(yīng)的間隙水致毒物質(zhì)鑒別技術(shù)進(jìn)展[J].生態(tài)毒理學(xué)報，2016,11(3):11-25

Wang Y T,Yu H X,Zhang X W,et al.Development of identification of key toxicants in the pore water[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3): 11-25(in Chinese)

沉積物間隙水是指沉積物顆粒之間及巖石顆粒之間孔隙的水溶液，包括強(qiáng)結(jié)合水、弱結(jié)合水、毛細(xì)管水和自由水。它是地球水圈的一部分，反映了沉積過程中及沉積后發(fā)生的各種變化歷程。在沉積物體系中，污染物在間隙水與沉積物間存在著吸附-解吸平衡，如圖1所示。

沉積物中富集了大量由人類活動產(chǎn)生，并通過直接或間接過程釋放到自然環(huán)境中的污染物質(zhì)。在一定條件下，沉積物中的污染物質(zhì)又可重新釋放到水體中，產(chǎn)生二次污染[2]。水體沉積物與其間隙水在化學(xué)物質(zhì)的遷移轉(zhuǎn)化過程起到了至關(guān)重要的作用，與整個生態(tài)環(huán)境和人類健康有著密切聯(lián)系[3]。Ankley、Adams和Di Toro等學(xué)者[4-6]的研究表明，沉積物和間隙水中銅、鎘和非離子有機(jī)物的濃度存在較好的相關(guān)性，間隙水的成分特征可以綜合反映沉積物的污染水平。

污染物在沉積物中可能有很高的檢測濃度，但大部分污染物附著在固相顆粒上，表現(xiàn)出緩慢的釋放速率與較低的生物可利用性[7]。污染物只有吸附在無定型的或水可浸潤的有機(jī)物表面及親水礦物表面才可參與吸附-解吸過程，因其與固相沉積物結(jié)合能較低，所以易于解吸到間隙水中[1]。

圖1 污染物在沉積物中的吸附概念模型［1］

在沉積物體系中，通常認(rèn)為可被生物直接接觸的物質(zhì)才是生物可利用的，主要包括溶解在間隙水中或能夠快速解吸的化合物，所以間隙水更加真實地反映水生生物的實際暴露情況。已有研究證明底棲動物受到的毒性脅迫程度，與污染物在孔隙水中的濃度有著直接關(guān)系。Whiteman等學(xué)者[8-9]分別進(jìn)行了加標(biāo)沉積物和間隙水的對搖蚊、鉤蝦等底棲生物的暴露試驗，發(fā)現(xiàn)在相同水體濃度下，氨氮的毒性效果相近，說明沉積物中氨的生物可利用性和毒性可以通過間隙水準(zhǔn)確預(yù)測。此外，水位波動或沉積物擾動會使間隙水大量進(jìn)入到地表水造成短暫的脈沖，直接威脅了生活在地表水中的生物[10]?？茖W(xué)準(zhǔn)確地對間隙水進(jìn)行毒性評估，能很大程度上反映沉積物的污染水平和潛在風(fēng)險。

間隙水一方面可以很大程度上反映沉積物的污染狀況，另一方面對水生生物產(chǎn)生著直接的影響，是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成。對間隙水進(jìn)行主要致毒物質(zhì)的鑒別是風(fēng)險評價和污染控制的基礎(chǔ)，對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康都有著十分重要的意義。本文綜合比較了沉積物間隙水的提取方法，并詳細(xì)綜述了已有的間隙水致毒物質(zhì)分類及鑒別的方法及具體應(yīng)用實例，同時探討了存在的問題及發(fā)展方向，為我國間隙水關(guān)鍵致毒物質(zhì)鑒別方法體系的建立提供借鑒。

1 間隙水的提取方法

間隙水的提取是完成間隙水毒性評估與毒物鑒別的首要步驟也是關(guān)鍵步驟，提取過程對間隙水中污染物的組成、性質(zhì)及毒性有著直接影響。常用的間隙水提取方法有離心法、壓榨法、真空抽取法和滲析法等。其中，離心法和壓榨法主要通過對沉積物的擠壓作用獲取間隙水，屬于非原位提?。徽婵粘槿》ê蜐B析法屬于原位提取，這類方法不改變間隙溶液的原始氧化還原狀態(tài)和溫度條件，對沉積物結(jié)構(gòu)的破壞性小。沉積物中存在一些對氧化還原、吸附解吸及沉淀溶解過程敏感的組分，如硫化物、疏水性有機(jī)物及鐵、錳還原態(tài)金屬等，間隙水的提取方法對其中污染物質(zhì)的濃度和形態(tài)都至關(guān)重要。到目前，間隙水的提取已發(fā)展了多種方法，它們有著不同的機(jī)理和適用范圍。下面分別介紹和比較一些常見的間隙水提取方法。

1.1 離心法

離心法是將采集來的沉積物，放入離心管中，以某一轉(zhuǎn)速離心一段時間，取上清液，制得間隙水[11]。離心法是一種獲取生物測試所需大量間隙水的簡捷方法，因此目前間隙水研究中多采用離心法。由于離心力的擠壓作用，沉積物顆粒上的吸附態(tài)成分易進(jìn)入間隙水中，所以離心條件(溫度、離心力、離心時間)的選擇對于間隙水化學(xué)組成存在較大影響。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)建議采用“溫和”的離心方式，即在4℃或生物測試的溫度下以2 000 g到10 000 g速度離心30 min，但相關(guān)文獻(xiàn)中報道的離心條件各不相同[12-15]，尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Carignan等[16]比較了5 000 r·min-1和11 000 r·min-1離心所得到間隙水，發(fā)現(xiàn)二者Cr、Co和Ni的濃度近似，而5 000 r·min-1離心的間隙水中含有更高濃度的Cu、Zn和有機(jī)碳。Ankley等[17]分別采用2 500 g和10 000 g離心沉積物。其中，2 500 g離心法取得的間隙水中的金屬(Cu、Pb、Zn)濃度相對高于10 000 g離心水，毒性當(dāng)量卻沒有成比例增加，暗示著2 500 g離心水中金屬的生物可利用性較低。間隙水前處理過程中的離心條件是影響其中污染物組成及毒性的重要因素，離心速率仍需進(jìn)一步的研究與歸納。

1.2 壓榨法

壓榨法是將沉積物裝入鋪有數(shù)層濾膜或細(xì)篩網(wǎng)的柱筒中，通過活塞加壓，擠壓出沉積物中的間隙水[18]。該方法操作簡單、速度快，特別適用于孔隙水大規(guī)模的提取。壓榨法的原理與離心法近似，但由于壓力作用，影響固-液界面間的交互，所得到的間隙水樣品中溶解組分的濃度往往大于自然狀態(tài)下實際孔隙自由水中的濃度，且濃度大小與施加的壓力直接相關(guān)。所以，榨取間隙水時通常采取較低的壓力(<10 bar)[19-20]，以減小所得樣品相對于實際環(huán)境中孔隙溶液的偏差。Hensen等學(xué)者[21]采用壓榨法采集分層后的柱狀沉積物中的間隙水，測定了不同深度的海底沉積物中SO2-4含量，發(fā)現(xiàn)其濃度變化趨勢與海底甲烷厭氧氧化活動(AOM)的強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，從而說明了AOM是海洋沉積物固定硫元素的一種重要方式。von der Wiesche等[22]采取壓榨法用于蘭河(萊茵河支流)沉積物間隙水的提取，裝置中使用了0.2 μm醋酸纖維素濾膜實現(xiàn)泥水分離，發(fā)現(xiàn)間隙水中亞硝酸鹽濃度與溫度變化顯著相關(guān)。

1.3 真空抽取法

真空抽取法采用一種直徑為2.4 mm的多孔聚酯管，尾部與注射器相連，取樣時，可原位直接將聚酯管插入沉積物中，用注射器負(fù)壓抽取溶液樣品[23]。該方法操作方便，樣品不與大氣直接接觸，防止了間隙水的氧化，且不改變采樣點沉積物的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，能一定程度上反映天然沉積物的真實情況。但該裝置僅能采集少量樣品，否則采樣深度難以控制，還有可能混入上覆水，所以該方法難以應(yīng)用到常規(guī)的毒性測試中[17]。相似原理的提取方法還包括吸氣引液法，該方法的裝置主要由真空泵、吸濾器和收集瓶3部分組成，使用時把吸濾器插入沉積物中，通過真空泵的抽力原位提取間隙水[24]。近年來，Burton等[25]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：將錐形采水裝置與樹脂吸附和生物暴露部分組合為一體，錐形頭內(nèi)部填有玻璃棉過濾細(xì)顆粒泥沙，使用時將采樣頭插入沉積物中，裝置頂端接有硅膠軟管，并通過蠕動泵持續(xù)抽取間隙水，并原位進(jìn)行生物測試。這種裝置較注射器抽取更為方便，但使用時仍要注意控制低流速(約25 mL·h-1)且不宜抽取過多間隙水。

1.4 滲析法

間隙水滲析裝置是由有機(jī)玻璃板制成，其中包含垂直分布的一系列腔體，腔體上面覆有一層滲透膜，保證水中離子可自由通過。采樣時將腔體內(nèi)充滿去離子水，隨后把裝置垂直插入沉積物中，待測離子通過擴(kuò)散作用進(jìn)入腔體中，平衡后取出即可用于后續(xù)分析[26]。這種方法設(shè)備十分簡單，操作方便，與離心法和壓榨法相比，該方法不破壞沉積物自身結(jié)構(gòu)，同時大大降低了對氧化還原電位(Eh)的影響程度[27]。現(xiàn)已有商品化的采樣器——peeper應(yīng)用在沉積物和孔隙水的研究中[28]。peeper上有26個小室并行排列，間隔1 cm，每一小室體積約為25 mL，小室上覆蓋孔徑為0.45 μm具生物惰性的滲析膜，使用時用雙面夾板固定于采樣器主體板上即可[29]。Lewandowski等學(xué)者[30]利用peeper滲析裝置發(fā)現(xiàn)搖蚊幼蟲的活動能顯著減少間隙水中磷酸鹽、銨根離子和鐵離子的濃度。但由于滲透膜及腔體的限制，該設(shè)備采樣量小且僅能應(yīng)用于間隙水中各種陰離子的分析檢測，而未能有更廣泛的運(yùn)用范圍。

以上4種常用的提取技術(shù)各有利弊。可以依據(jù)不同的研究對象和研究目選用不同的方法。Ankley等學(xué)者[17]對2個位點采用4種方法提取間隙水：離心法、壓榨法、真空抽取法和滲析法，指出了僅離心法是可提取足夠生物測試需要的水量的較方便的方法，其余3種方法過于費(fèi)時費(fèi)力。Ozretich等[31]分別測定了原位滲析法(peeper)和離心-過濾法所得間隙水中幾種組分的含量，發(fā)現(xiàn)2種樣品中氯化物和溴化物的濃度近似，而離心水中的氨氮和溶解性磷酸鹽濃度明顯高于滲析水，從而指出離心過程中對沉積物的擠壓作用可能破壞了氨氮和磷酸鹽的吸附解吸平衡。Winger等[32]針對4個采樣點對比了3種間隙水提取方法(滲析法、離心法、真空抽取法)對金屬離子濃度的影響。發(fā)現(xiàn)對于常量金屬(K、Ca、Na、Mg等)，3種方法所得到的濃度近似；但滲析法和真空抽取法所得到的間隙水中Cu和Pb的濃度顯著小于離心法，說明離心過程的擠壓作用明顯大于滲析法和真空抽取法，所得水樣混入了更多毛細(xì)管水，導(dǎo)致微量金屬的濃度顯著增加，常量金屬由于本底值較大所以變化不明顯。綜上所述，離心法和壓榨法適用于提取毒性試驗所需要的大量間隙水，而真空抽取法和滲析法所采集的水樣與實際沉積物中的間隙水更接近。

此外，不同的保存方式也會影響間隙水樣品的性質(zhì)。Otero等學(xué)者[33]發(fā)現(xiàn)，同時將沉積物樣品和間隙水樣品冷凍保存一個月后，以沉積物方式保存的樣品提取出來的間隙水熒光特征發(fā)生了明顯變化，而以間隙水方式保存的樣品變化不大。Carr等[20]的工作也證明了，隨著時間的推移，保存于4℃的沉積物中提取的間隙水的毒性也發(fā)生了很大變化。這些問題說明，樣品的保存方法對于間隙水的毒性測試和分析檢測都至關(guān)重要，直接保存間隙水是一種較為科學(xué)的方法。

2 間隙水的毒性鑒別評估方法

間隙水樣品的毒性往往是多種污染物及各種復(fù)雜中間產(chǎn)物的復(fù)合作用的結(jié)果，選定特征污染物的毒性并不能準(zhǔn)確代表間隙水的毒性，所以傳統(tǒng)基于特征污染物(或優(yōu)先污染物)的毒性評價方法無法全面反映間隙水的毒性水平。而生物毒性試驗的方法雖然反映了間隙水的整體毒性，但對于產(chǎn)生毒性的真正原因未能做出判定，無法服務(wù)于后期的管理需求[34]。

美國環(huán)境保護(hù)局(Environmental Protection A-gency,EPA)在原有廢水毒性鑒別評估方法的基礎(chǔ)上，推出了水體沉積物毒性鑒別評價程序[35]，它利用樣品中化合物不同的理化特征實現(xiàn)不同類型致毒物的分離，并結(jié)合毒性測試，鑒別致毒物質(zhì)類型。該程序現(xiàn)已成為制定環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)、進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險評價和管理的關(guān)鍵步驟。水體沉積物毒性鑒別評估(Toxicity Identification Evaluation,TIE)分為全沉積物TIE和間隙水TIE。全沉積物TIE以沉積物作為試驗相。沉積物是一種非均勻的介質(zhì)，生活在其表面或內(nèi)部的底棲生物通過上覆水、孔隙水、或直接接觸沉積物等多種方式接觸并吸收有害化學(xué)物質(zhì)[36]，因此全沉積物毒性試驗是一種能較全面反映受試生物受到污染沉積物的損害的方法。但全沉積物TIE試驗周期長、操作繁瑣，且底棲生物大多敏感性較差，所以已有研究較少。相對于全沉積物TIE，間隙水TIE的發(fā)展更為完善。

圖2 間隙水毒性鑒別評估流程

間隙水TIE與廢水TIE類似，一般包括3個階段：毒性表征、毒性鑒別和毒性確認(rèn)(圖2)。在毒性表征階段，通過運(yùn)用適當(dāng)?shù)奈锢砘瘜W(xué)方法，目標(biāo)性地去除或屏蔽某一類物質(zhì)，結(jié)合處理前后的生物毒性試驗，初步判斷引起毒性的大致污染物類型。處理方式包括：pH梯度調(diào)節(jié)試驗用于表征毒性依賴pH變化的物質(zhì)，曝氣試驗用于去除揮發(fā)性或易被氧化的物質(zhì)，C18固相萃取去除非極性有機(jī)物，乙二胺四乙酸(EDTA)螯合試驗屏蔽重金屬，沸石/石莼吸附處理去除氨氮等[35]。因為第一階段“毒性表征”主要針對4類污染物：氨氮、重金屬、非極性有機(jī)物和硫化物，所以第二階段“毒性鑒別”過程主要從這4個方面展開。針對氨氮，采用離子選擇性電極或納氏試劑比色法即可直接測定濃度。同樣，對于重金屬，則直接使用火焰原子吸收或電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行定量測定，此外，還可以使用陽離子交換樹脂，對比吸附前后毒性變化以驗證第一階段的結(jié)果，然后洗脫樹脂，用于金屬濃度進(jìn)行分析和進(jìn)一步的毒性測試。由于非極性有機(jī)物成分復(fù)雜，所以需要采用分級分離的方法來降低有機(jī)致毒物的復(fù)雜性從而有助于鎖定目標(biāo)污染物。常用的策略是固相萃取富集樣品后，采用不同極性的溶劑洗脫分成若干組分，并使用高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等，鑒別和測定各組分中的可能致毒的有機(jī)物。此外，在缺氧沉積物中，由于微生物的活動易產(chǎn)生大量硫化物，間隙水中溶解態(tài)的硫化物對水生生物存在毒性效應(yīng)。硫化物的毒性和揮發(fā)性都隨pH下降而升高，所以依據(jù)毒性表征階段的pH調(diào)節(jié)試驗可以初步判斷。在毒性鑒別階段可以采用比色法或離子選擇電極法對硫化物進(jìn)行測定。第三階段毒性確認(rèn)是為了確定化合物在總效應(yīng)中的貢獻(xiàn)率。主要的方法有相關(guān)分析法、可疑致毒物質(zhì)添加法、不同物種的敏感度比較、癥狀觀察、生物標(biāo)志物法和添加增效劑/拮抗劑的方法等[35]。適用于間隙水TIE的受試生物有網(wǎng)紋溞(Ceriodaphnia dubia)、蚤狀溞(Daphnia pulex)、大型溞(Daphnia magna)、帶絲蚓(Lumbriculus variegatus)、呆鰷魚幼魚(Pimphlales promelas)、糠蝦(Americamysis bahia mysidshrimp)和端足類(Ampelisca abdita,Hyalella azteca)等。但有一些生物如鉤蝦(Hyalella azteca)和搖蚊幼蟲(Chironomussp.)不能適應(yīng)完全的水體暴露，試驗時需要加入一層很薄的潔凈石英砂作為基質(zhì)。

TIE方法最初發(fā)源于北美，用于市政及工業(yè)廢水中致毒物質(zhì)的鑒定。1991年美國環(huán)境保護(hù)局德魯斯環(huán)境研究實驗室將廢水TIE方法進(jìn)行了修改，并應(yīng)用于沉積物的間隙水中[37]。之后Schubauer-Berigan等[15]、Wenholz等[38]、Gupta等[39]、Karuppiah等[40]科學(xué)家將TIE方法廣泛應(yīng)用于不同污染類型的池塘、河流、海灣等點位的間隙水中，驗證了該方法的實用性，并推動了TIE的普及與發(fā)展。2007年，該實驗室又進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，總結(jié)出了更為詳細(xì)的間隙水TIE方法文件[35]。迄今為止，間隙水TIE已經(jīng)在海洋和淡水沉積物中得到了較為廣泛的應(yīng)用，并成功鑒別出了包括重金屬、S2-、氨氮、有機(jī)氯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等多種類型的關(guān)鍵致毒物質(zhì)(見表1)。

3 基于毒性效應(yīng)的間隙水有機(jī)毒物鑒別方法

傳統(tǒng)的TIE過程可有效測定重金屬、氨氮和硫化物，但鑒別有機(jī)致毒物質(zhì)的能力仍十分有限。過去20年的TIE研究結(jié)果表明，約有70%的沉積物和間隙水的毒性效應(yīng)與非極性有機(jī)物有關(guān)[46]，如圖3所示。環(huán)境樣品中污染物成分復(fù)雜，可能存在著成百上千種有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，這對主要毒性貢獻(xiàn)物質(zhì)的鑒別造成很大的基質(zhì)干擾。污染物識別(Effect Directed Analysis,EDA)方法將有機(jī)污染物精細(xì)分離與毒性測試結(jié)合起來，是一種可有效降低樣品復(fù)雜性從而鎖定目標(biāo)污染物的策略。

從環(huán)境樣品中提取出來的有機(jī)物首先要經(jīng)過分級分離分配為若干組分，分離過程可以基于分析物的多種物理化學(xué)性質(zhì)(極性、疏水性、分子大小、平面性和特定官能團(tuán)等)來實現(xiàn)[47]，分離手段包括：固相萃取分離、正/反相液相色譜、凝膠排阻色譜、薄層色譜等[34]，接著對每個組分進(jìn)行生物試驗來評估毒性大小，并舍去無毒組分從而達(dá)到降低有機(jī)提取物的復(fù)雜性的目的。經(jīng)過反復(fù)上述過程，最終確定下來的毒性組分用于關(guān)鍵致毒物質(zhì)識別?；衔锏暮Y選與識別主要借助質(zhì)譜對毒性組分的全掃描和化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)譜庫兩大工具實現(xiàn)，有時也會配合核磁共振和紫外/紅外吸收光譜等鑒定手段[48]。EDA中適用的毒性測試方法較TIE更為廣泛，主要分為整體生物測試和體外毒性測試。整體生物測試基于蚤類、甲殼類及魚類等個體生物的毒性試驗方法，以死亡、生長、繁殖等指標(biāo)作為毒性終點。體外毒性測試主要采用離體的細(xì)胞、菌株等，測試某一特定的毒性效應(yīng)，目前發(fā)展較成熟的包括遺傳毒性效應(yīng)、芳烴受體效應(yīng)和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等[49]?；趥€體水平的測試方法可反映污染物質(zhì)對生態(tài)系統(tǒng)的影響，而體外毒性測試可表征致毒物質(zhì)的作用機(jī)制。

圖3 水體沉積物和間隙水中各類污染物毒性貢獻(xiàn)分配情況

表1 間隙水TIE 應(yīng)用實例Table 1 Applications of interstitial water TIE methods

續(xù)表1

由于間隙水通常較難獲取，而精細(xì)分離過程往往對樣品的需求量很大，所以針對間隙水的有機(jī)致毒物質(zhì)識別的研究還不多見[49]。Kosian等學(xué)者[50]最初進(jìn)行了這方面的嘗試，他們采集了美國蘇比利爾一個煉油廠排放口附近的小溪中的沉積物，并采用4℃下10 000 g離心30 min的方式提取了5 L間隙水，利用帶絲蚓測試出其間隙水存在紫外光誘導(dǎo)的毒性，隨后使用固相萃取富集了間隙水中的有機(jī)物，并用HPLC將有機(jī)提取物分離為20個組分并分別進(jìn)行了毒性測試，篩選出的致毒組分通過GCMS全掃描并結(jié)合經(jīng)驗毒性數(shù)據(jù)和預(yù)測模型來識別主要致毒物質(zhì)，最終鑒別出一些取代的多環(huán)芳烴和雜原子的多環(huán)芳烴可能是造成光誘導(dǎo)毒性的主要貢獻(xiàn)物。Fang等學(xué)者[51]將非致死的毒性指標(biāo)運(yùn)用到間隙水EDA中，從而提高了毒性終點的敏感性，大大減少了間隙水的用量。他們采用絮凝和2 500 g離心的方式收集到了320 mL美國伊麗莎白河道中沉積物間隙水，并以斑馬魚為受試生物測試了間隙水的毒性，發(fā)現(xiàn)其中的溶解態(tài)物質(zhì)可導(dǎo)致斑馬魚急性毒性和心臟畸形。隨后將間隙水中有機(jī)物富集后采用尺寸排阻色譜和正相色譜進(jìn)行分級分離，并以心包囊腫作為生物測試的毒性終點鎖定致毒組分，致毒物的鑒別采用了電子電離源的氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/EI-MS)并結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫與質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，最終識別出芳烴受體(AhR)激動劑(1,2-苯并芴、1,2-苯并蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘)和細(xì)胞色素P450A1抑制劑(二苯并噻吩、熒蒽)是主要毒性貢獻(xiàn)物質(zhì)。

由此可見，TIE方法主要用于確認(rèn)致毒物質(zhì)的類型，基于有機(jī)污染物精細(xì)分離鑒別的EDA可有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)TIE在有機(jī)致毒物鑒別方面的不足，是環(huán)境樣品致毒物鑒別的有力工具。首先對樣品進(jìn)行毒性表征確定基本致毒物類型，若為有機(jī)物質(zhì)，則進(jìn)行EDA的精細(xì)分離與高通量篩查，最后將識別出具體化合物應(yīng)用于毒性確認(rèn)[49]。間隙水作為沉積物的重要組成，可以在很大程度上反映沉積物的污染狀況，是一種較優(yōu)的試驗相，間隙水中溶解的物質(zhì)可被生物體直接接觸或攝入，且EDA實驗過程中可以采用與傳統(tǒng)TIE相同的試驗相，使2個過程得到較好的銜接，從而試驗結(jié)果更有說服力。

除此之外，沉積物EDA還可以結(jié)合一些其他體現(xiàn)生物可利用性的提取或暴露方式與間隙水TIE銜接。提取方式包括丁醇萃取、超臨界流體萃取、TENAX樹脂仿生提取和環(huán)糊精提取等。其中丁醇萃取和超臨界流體萃取屬于溫和溶劑提取，利用提取溶劑對有機(jī)物質(zhì)適當(dāng)?shù)娜芙饬?，仿生萃取沉積物中的有機(jī)物，時間是提取量主要控制因素。丁醇仿生萃取是將15 mL正丁醇加入到5～10 g沉積物中，振蕩5 s后分離出正丁醇，其中溶解的組分便認(rèn)為是生物有效性的[52]。Hawthorne等學(xué)者[53]曾采用200個大氣壓和50℃的超臨界CO2，以4 mL·min-1的流速對8 g土壤進(jìn)行了40 min的提取，萃取出了生物可利用的PAHs。TENAX樹脂提取與環(huán)糊精提取有著相似的機(jī)理，即建立沉積物-水-吸附劑三相體系，吸附在沉積物中的物質(zhì)由于附著力的不同，導(dǎo)致其溶解到水中速率有快有慢，而吸附劑可快速吸附水中有機(jī)物質(zhì)，于是可以通過控制萃取時間實現(xiàn)沉積物中易解吸物質(zhì)的提取[54]。Puglisi等[55]采用1 g干沉積物與10 mL 50 mmol·L-1環(huán)糊精混合振蕩14 h的方式提取了生物可利用的二噁英、PAH和PCB類等疏水性有機(jī)物。Cornelissen等學(xué)者[56]將1.5 g TENAX樹脂與1 g干沉積物加入70 mL去離子水中，分別進(jìn)行了6 h與30 h的振蕩萃取，發(fā)現(xiàn)30 h提取的氯苯(chlorobenzenes,CBs)、PCBs、PAHs僅為6 h提取的2.8倍，說明30 h的TENAX提取已包含了沉積物中非快速解吸的成分。暴露方式主要依據(jù)分配平衡原理，采用主動暴露方法，即將處理后的沉積物提取物滴加到固體吸附劑上來模擬沉積物對受試生物進(jìn)行水暴露，該方法往往要求固體吸附劑與沉積物有著相似的吸附能力，且與水溶液能達(dá)到快速平衡。常用的材料包括半透膜裝置(semipermeable membrane devices,SPMD)和硅膠棒、硅膠環(huán)等。將低密度的聚乙烯薄膜制成2.5 cm寬100 μm厚條形袋，內(nèi)部填有溶解在三油酸甘油酯中的沉積物提取物，即制成半透膜裝置(semipermeable membrane devices,SPMD)，使用時將薄膜纏在支架上便可用于仿生暴露[57]。將硅膠作為平衡給樣材料時，通常將沉積物的提取液負(fù)載到硅膠上，緩慢氮吹干后即可用于水體暴露。為了配合不同的暴露生物和容器，可將硅膠吸附劑制成不同的形狀，如Bandow等[58]選擇硅膠棒用于小試管中的綠藻暴露，Smith等[59]選擇硅膠環(huán)用于24孔板的細(xì)胞暴露等。

4 原位間隙水毒物鑒別

目前絕大多數(shù)間隙水中致毒物質(zhì)的鑒別工作是在實驗室中完成的。然而，當(dāng)從自然水體中采集水樣及沉積物樣品時，采樣過程對沉積物結(jié)構(gòu)的破壞，儲存和運(yùn)輸過程溫度、光照、氧化還原等環(huán)境條件的變化，及器壁對疏水性有機(jī)物的吸附作用，都有可能導(dǎo)致樣品的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化進(jìn)而直接影響污染物的總量、存在形式和生物可利用性等。因此人為操作越少，對實際環(huán)境污染水平及風(fēng)險的評價就越準(zhǔn)確。

基于這些原因，Burton等[25,60]設(shè)計了原位的間隙水TIE裝置。該裝置借鑒了吸氣引液法抽取間隙水的原理，采用自制的采水頭抽取間隙水。采水頭由有機(jī)玻璃制成從而減少對有機(jī)物質(zhì)的吸附，內(nèi)部填有玻璃棉起到過濾作用。間隙水被抽出后流入填有不同吸附材料的吸附柱內(nèi)。參照EPA中對間隙水TIE的描述，針對氨氮、重金屬和非極性有機(jī)物3種主要致毒物質(zhì)選擇了特異性的吸附材料：采用沸石吸附氨氮，以亞氨基二乙酸為官能團(tuán)的螯合樹脂(Chelex 100)吸附重金屬，采用大孔樹脂(Ambersorb 563)吸附有機(jī)物。經(jīng)過選擇性吸附的間隙水進(jìn)入生物暴露部分，選用大型溞作為測試生物，并在暴露室中插入一根透氣的硅膠管用于充氧。暴露室頂部接有泵管，由蠕動泵提供動力持續(xù)將間隙水抽出并使其依次流經(jīng)吸附材料和暴露室。

運(yùn)用此裝置對含有氨、鎘、熒蒽的加標(biāo)水樣和泥樣的預(yù)實驗結(jié)果表明，3種吸附材料可以選擇性地吸附目標(biāo)物，沸石和螯合樹脂對氨和鎘的吸附稍有重疊。隨后應(yīng)用到已知有PAHs和PCBs污染的3條河流中，進(jìn)過24 h的毒性暴露，原位TIE結(jié)果表明間隙水中的主要致毒物質(zhì)為非極性有機(jī)物，而實驗室TIE中有2條河流樣品并未觀察到明顯毒性。說明原位的間隙水TIE方法大大減少了實驗操作從而能夠減少致毒物質(zhì)的損失，比實驗室TIE方法更靈敏且更能反映實際環(huán)境的污染狀況。

對于間隙水TIE，原位試驗方法可以減小間隙水采集及處理過程中的工作量，且采集間隙水對沉積物破壞小，能更真實地反映沉積物中自由水的毒性狀況。同時，原位間隙水TIE中使用的吸附材料還可以在實驗室洗脫，用于后續(xù)的致毒物鑒別和確認(rèn)等。但由于環(huán)境復(fù)雜，仍存在著較多不可控因素，如溫度、光照強(qiáng)度、溶解氧、微生物活性等，這些因素可能會影響試驗生物對污染物的響應(yīng)或直接對試驗生物產(chǎn)生抑制[61]，從而干擾原位TIE的毒性結(jié)果。若原位毒性試驗采用大型溞為受試生物，則要求暴露水體中一定的溶解氧含量，但自然狀態(tài)下的間隙水多為還原態(tài)，曝氣過程也會改變間隙水的氧化還原電位，并改變部分化合物的形態(tài)和毒性。此外，原位間隙水TIE還存在對試驗設(shè)備要求高，毒性結(jié)果重復(fù)性差，精確度差等問題。因此作為實驗室TIE的補(bǔ)充，原位TIE尚不能完全替代實驗室TIE且有待進(jìn)一步發(fā)展。

5 間隙水毒物鑒別的當(dāng)量計算

毒物鑒別過程中，毒性結(jié)果的量化對于評估化合物的毒性貢獻(xiàn)和環(huán)境樣品可能的生態(tài)風(fēng)險都十分重要。過去對毒性的描述多采用EC50(半數(shù)效應(yīng)濃度)等來表示，此方法計算簡單，但不能將環(huán)境樣品和化合物的毒性結(jié)果有效的結(jié)合。所以近年來許多毒性評價方法被提出和發(fā)展起來，比較常見的有毒性單位法(Toxic Unit,TU)和毒性當(dāng)量法(Toxic E-quivalent Quantity,TEQ)。

毒性單位法主要適用于評價以發(fā)光細(xì)菌、藻類、多毛類和甲殼類等個體生物為受試生物的急性毒性試驗結(jié)果[62]，環(huán)境樣品毒性單位(TUs)的計算公式如下。

公式中IC50(或EC50)為受測生物半數(shù)出現(xiàn)毒性效應(yīng)(死亡，發(fā)光抑制或生長抑制等)時，環(huán)境樣品的稀釋倍數(shù)或濃縮倍數(shù)。

環(huán)境樣品中化合物的毒性單位的計算公式如下。

公式中IC50(或EC50)為受測生物半數(shù)出現(xiàn)毒性效應(yīng)(死亡，發(fā)光抑制或生長抑制等)時待測化合物的濃度。

環(huán)境樣品的TU值越大，說明環(huán)境樣品的危害就越大，環(huán)境中檢測到的化合物的TU值越大，則該環(huán)境樣品中此化合物的毒性貢獻(xiàn)越大。

毒性當(dāng)量法是EDA中應(yīng)用廣泛的毒性評價方法之一，最初被應(yīng)用于類二噁英物質(zhì)的毒性評價中。計算毒性當(dāng)量時，引入了相對影響因子(Relative Potency,REP)的概念，即在評價毒性時，需選定公認(rèn)的效應(yīng)最強(qiáng)的化合物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。如在評價類二噁英毒性時，一般采用2,3,7,8-四氯代二苯-并-對二噁英(2,3,7,8-TCDD)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[63]，評價雌激素活性時一般采用17β-雌二醇(E2)[64]，評價雄激素活性時一般采用雙氫睪酮(DHT)[65]?；衔锏南鄬τ绊懸蜃佑嬎愎饺缦拢?/p>

環(huán)境中檢測到的所有化合物的總相對影響因子計算公式如下：

評估環(huán)境樣品毒性大小時，則需要計算環(huán)境樣品的毒性當(dāng)量(TEQ)，計算方法如下：

一般通過比較環(huán)境樣品的TEQ和化合物的REP來評估環(huán)境樣品中主要毒性貢獻(xiàn)物：TEQ等于∑REP時，說明所測化合物恰好完全解釋毒性的來源，是毒性的主要貢獻(xiàn)者；當(dāng)TEQ大于∑REP時，說明所檢測到的化合物不能完全解釋毒性的來源，還有未檢測到的化合物對環(huán)境樣品的毒性有貢獻(xiàn)或者檢測到的化合物之間存在協(xié)同作用；當(dāng)TEQ小于∑REP時，說明測得的各化合物之間可能存在拮抗作用。

毒性單位法和毒性當(dāng)量法簡單易懂，實用性強(qiáng)，已被許多國家和單位應(yīng)用在廢水、沉積物、活性污泥等的毒性評價與管理中[66]。同時，該方法也是致毒物鑒別研究中的常用方法，Phillips等[67]在加利福尼亞海灣沉積物及間隙水的TIE研究中，采用毒性單位法確定了有機(jī)物為主要的致毒物類。Shi等[68]學(xué)者采用毒性當(dāng)量法鑒別出江蘇地區(qū)飲用水中甲狀腺激素效應(yīng)的主要貢獻(xiàn)物為鄰苯二甲酸二丁酯。

采用毒性單位法和毒性當(dāng)量法有3個基本假設(shè)：(1)采用的毒性終點的劑量-效應(yīng)曲線應(yīng)為單調(diào)函數(shù)；(2)各毒性貢獻(xiàn)物對被試生物有著相似的作用方式(mode of action,MOA)，毒性作用可直接相加；(3)各化合物與樣品的劑量-效應(yīng)曲線都是平行的，從而選取任意效應(yīng)水平的點計算，其最終毒性貢獻(xiàn)比例不變[71]。這些條件大大縮小了毒性當(dāng)量與毒性單位計算的應(yīng)用范圍，在大部分情況下，3個假設(shè)很難同時滿足，所以采用毒性單位法或毒性當(dāng)量法可能會給實驗結(jié)論帶來較大的誤差。一般情況下劑量-效應(yīng)曲線為單調(diào)的S型曲線，但酶活測試中可能會出現(xiàn)倒U形曲線，如虹鱒魚肝細(xì)胞中的EROD (ethoxyresorufin-O-deethylase)酶，鹵代芳烴的低濃度暴露時會誘導(dǎo)EROD酶，高濃度時則引起細(xì)胞毒性抑制酶的產(chǎn)生，從而酶活性受2種因素控制，無法用于毒性貢獻(xiàn)計算[72]。Walter等[71]挑選了11種結(jié)構(gòu)差異較大擁有不同MOA的優(yōu)先控制污染物用于綠藻急性毒性試驗，基于不同的毒性水平計算，發(fā)現(xiàn)單純將各化合物TU加和會導(dǎo)致毒性高估1.6～5.0倍。Grote等[72]曾對瑞典西海岸的沉積物進(jìn)行EDA分析，鑒定出了造成綠藻毒性的芳香類物質(zhì)，隨后基于沉積物提取液及各化學(xué)品的劑量-效應(yīng)曲線，比較了不同效應(yīng)水平上提取液TU與各化學(xué)品TU加和的比值，記為確認(rèn)質(zhì)量指數(shù)(index of confirmation quality,ICQ)，最終發(fā)現(xiàn)基于EC90比基于EC20所計算的ICQ高10倍，效應(yīng)水平的選擇對于毒性貢獻(xiàn)的計算影響巨大?；诖?，Villeneuve等[73]提出了采用REP20-80的描述方式，即在分析毒性結(jié)果時，同時考慮到EC20、EC50、EC80三個效應(yīng)水平的點，以減小各化合物與樣品間劑量-效應(yīng)曲線斜率不一致所帶來的誤差。雖然REP20-80的描述方法較單效應(yīng)點的表征方法更為全面，但較適用于樣品間的比較，在計算毒性當(dāng)量的貢獻(xiàn)時則描述過于籠統(tǒng)。Shi等學(xué)者[74]利用蒙特卡羅模型，擬合了鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的抗甲狀腺激素活性當(dāng)量的REP的概率密度分布曲線，發(fā)現(xiàn)最大概率的效應(yīng)區(qū)間為7%～25%而非50%，并基于化合物的最大概率效應(yīng)水平計算了各自的REP。相對于根據(jù)EC50效應(yīng)計算造成毒性效應(yīng)的低估，該方法更能準(zhǔn)確反映實際毒性貢獻(xiàn)情況。盡管已進(jìn)行了初步嘗試，如何更加準(zhǔn)確全面地量化和比較毒性數(shù)據(jù)結(jié)果，仍需要不斷的發(fā)展與完善。

6 展望

間隙水TIE與EDA分析方法是間隙水中關(guān)鍵致毒物鑒別的強(qiáng)有力工具，已在一些污染區(qū)域的致毒物鑒別和風(fēng)險評估的應(yīng)用中發(fā)揮了重要作用。但間隙水中致毒物的鑒別方法仍需要一些發(fā)展與完善：(1)間隙水TIE雖然能夠鑒定出造成毒性的具體污染物種類，但是以間隙水為試驗相會忽略其他的暴露途徑(攝食過程、直接接觸固相沉積物等)，從而容易高估無機(jī)物的毒性并低估難溶于水的持久性有機(jī)物的毒性，使其仍然不能完全表征沉積物的潛在風(fēng)險。所以為了全面地表征沉積物毒性與風(fēng)險，應(yīng)同時對間隙水和沉積物的致毒物質(zhì)進(jìn)行鑒別，并相互對比印證得出結(jié)論。(2)將傳統(tǒng)TIE與基于有機(jī)污染物精細(xì)分離鑒別的EDA結(jié)合起來的基本條件是毒性終點一致，而EDA中分離技術(shù)復(fù)雜，這將直接導(dǎo)致鑒別過程往往需要大量間隙水以達(dá)到毒性測試要求。所以我們一方面需要開發(fā)用于大量采集間隙水的方法，另一方面應(yīng)該引入更為靈敏的生物效應(yīng)終點，以便間隙水致毒物鑒別更廣泛的應(yīng)用。(3)目前，按照氨氮、重金屬和有機(jī)污染物分類的致毒因子鑒別方法相對比較成熟，但是這種分類方法將大量性質(zhì)完全不同的有機(jī)污染物歸為一類是不科學(xué)的，而有機(jī)致毒物鑒別方面仍然存在諸多問題(成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾高、同分異構(gòu)體廣泛存在、數(shù)據(jù)庫資源不足、理論基礎(chǔ)匱乏等)。所以在未來的研究中應(yīng)進(jìn)一步發(fā)展有機(jī)物的精細(xì)分離技術(shù)和質(zhì)譜識別技術(shù)，建立一套科學(xué)完整的鑒別流程。(4)由于運(yùn)輸、保存和微生物活動等問題，實驗室中鑒別出的致毒物質(zhì)能否外推到實際環(huán)境中仍有待進(jìn)一步驗證。這就需要我們擴(kuò)大和推廣原位毒性試驗技術(shù)，積累豐富的實驗案例，在更高層次上歸納和理解原位與異位試驗的異同。

間隙水毒性測試和致毒因子鑒別是沉積物生態(tài)環(huán)境風(fēng)險評價的關(guān)鍵基礎(chǔ)，對保證水體生態(tài)環(huán)境安全具有重要意義。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，沉積物正在遭受著各類化學(xué)品的嚴(yán)重污染，但目前我國尚未提出間隙水相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)，而沉積物標(biāo)準(zhǔn)僅包括針對底棲生物的毒性測試和少數(shù)污染物質(zhì)的檢測方法，這將導(dǎo)致對沉積物體系的潛在風(fēng)險的描述過于片面，且難以指導(dǎo)污染控制和修復(fù)實踐。所以制定符合我國實際情況的間隙水提取方法標(biāo)準(zhǔn)及間隙水致毒物質(zhì)鑒別方法是風(fēng)險評價領(lǐng)域重要的研究方向。

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Development of Identification of Key Toxicants in the Pore Water

Wang Yuting,Yu Hongxia,Zhang Xiaowei,Shi Wei*

State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse,School of the Environment,Nanjing University,Nanjing 210023,China

6 December 2015 accepted 21 January 2016

Sediments act both as a sink and as a long-term source of toxicants,and are associated with potential ecological and human health risks closely.However,the pore water acts as a bridge for toxicants from sediment to biota,and only the freely dissolved molecules and rapidly desorbing molecules from sediments are bioavailable, Therefore,the identification of key toxicants in the pore water is necessary to risk assessment and comprehensive treatment of the pore water and sediment.Toxicity Identification Evaluation(TIE)and Effect Directed Analysis (EDA)have been successfully applied in toxicants screening and identification.In this paper,the extraction methods for the pore water were reviewed and compared.Application and development of TIE and EDA in identification of toxicants in the pore water are summarized,and the toxicity quantification methods with their restrictions were also proposed.On the basis of current studies,limitations and prospect of toxicants identification in the porewater were discussed,the loss of toxicity in ex situ bioassays and the challenge in identification of organic toxicants were also highlighted.

interstitial water;key toxicants;TIE;EDA;in situ

2015-12-06 錄用日期：2016-01-21

1673-5897（2016）3-011-15

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20151206001

簡介：史薇(1984—)，女，環(huán)境科學(xué)博士，副教授，主要研究方向為復(fù)合污染介質(zhì)中有機(jī)毒物分級鑒別與風(fēng)險評估，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

國家自然科學(xué)基金(21577058；21307054)；江蘇省自然科學(xué)基金青年項目(BK20130551)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃) (2013AA06A309)；國家環(huán)保部公益性行業(yè)科研專項(201409040)；國家水體污染控制與治理重大專項專題研究(2012ZX07101-003)；國家自然科學(xué)基金國際合作交流項目(21411120337)

王玉婷(1991-)，女，碩士研究生，研究方向為有機(jī)污染化學(xué)分析，E-mail:yutingwang_nju@163.com

*通訊作者（Corresponding author），E-mail:njushiwei@nju.edu.cn