李 飛，王曉磊，徐永清，張俊峰，董佳敏，苗 宇，馮 旭，李鳳蘭，胡寶忠,

(1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.哈爾濱學院，黑龍江哈爾濱 150086)

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低溫處理下東農(nóng)冬麥1號小麥根組織EXPA基因的表達分析

李 飛1，王曉磊2，徐永清1，張俊峰1，董佳敏1，苗 宇1，馮 旭1，李鳳蘭1，胡寶忠1,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.哈爾濱學院，黑龍江哈爾濱 150086)

寒地冬小麥膨脹素(Expansin)基因的表達特性同根系建成密切相關(guān)，而形成發(fā)達的根系是高寒地區(qū)冬小麥成功越冬返青的關(guān)鍵。為明確低溫對高寒地區(qū)冬小麥膨脹素基因表達特性的影響，進而提高冬小麥對寒冷的適應(yīng)性，以高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號為試驗材料，以正常冬小麥濟麥22號為對照材料，運用實時熒光定量PCR技術(shù)對經(jīng)不同低溫處理的小麥幼苗根組織中編碼α-expansin(EXPA)的基因 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7的表達特性進行分析。結(jié)果表明，在4 ℃、-10 ℃和-20 ℃低溫處理下，高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號中 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的相對表達量與對照相比呈現(xiàn)顯著性上升，其中，4 ℃處理條件下， TaEXPA6和 TaEXPA7基因的相對表達量變化幅度較明顯，-10 ℃處理條件下， TaEXPA5基因的相對表達量變化幅度較明顯，-20 ℃處理條件下， TaEXPA5和 TaEXPA7基因的相對表達量變化幅度較明顯。說明低溫影響小麥根組織中 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的表達，三個基因與抗御低溫脅迫具有相關(guān)性，并且各基因表達存在一定的協(xié)作性。

低溫；高抗寒冬小麥；EXPA；實時定量PCR

黑龍江省位于溫帶大陸性季風氣候地帶，一般1月份氣溫最低達-41～-33 ℃，嚴重制約著越冬性冬小麥的生長[1-2]。雖然冬小麥具有一定的抗寒能力，但返青期由于溫度較低而生長變緩，會導(dǎo)致其抗寒能力減弱，加之在高寒地區(qū)倒春寒現(xiàn)象頻繁發(fā)生，嚴重限制著冬小麥種植區(qū)域的擴大[3-5]。因此，研究冬小麥的抗寒性，對于豐富植物抗寒理論、擴大高寒地區(qū)土地復(fù)種指數(shù)具有重要意義。

東農(nóng)冬麥1號是2007年黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會命名的，由東北農(nóng)業(yè)大學歷經(jīng)13年培育而成的高抗寒品種(I級)[6]。目前，對東農(nóng)冬麥1號已有所研究，但大多是有關(guān)在生理和細胞超微結(jié)構(gòu)等方面來適應(yīng)高寒地區(qū)氣候的研究。蒼 晶等[7]研究表明，溫度降低時，東農(nóng)冬麥1號自身保護性物質(zhì)的積累及抗寒基因的表達可耐-30 ℃的低溫，在黑龍江省連續(xù)5年內(nèi)種植其成功越冬返青率均高于85%。馮玉磊等[8-9]研究表明，東農(nóng)冬麥1號的根系較發(fā)達，對低溫等脅迫具有一定抵抗力，成為冬小麥在高寒地區(qū)成功越冬的關(guān)鍵。而有關(guān)其分子抗凍機理方面的研究尚未有明確報道。

近年來，植物根系生長發(fā)育的調(diào)控越來越受到大家的關(guān)注，植物根系的生長發(fā)育受多基因表達、激素合成與轉(zhuǎn)運及外界環(huán)境等多種因素的共同調(diào)控和影響，不僅取決于細胞數(shù)量的增加，還與細胞的自身擴展密不可分，細胞壁會在一定程度上限制植物根系細胞生長，細胞壁的膨脹是植物根系細胞伸長的前提。膨脹素(Expansin)又稱擴張素或擴張蛋白，由α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、γ-expansin(EXLA)和δ-expansin(EXLB)四個亞家族組成，是植物生長過程中釋放的一種細胞壁松弛因子，影響著細胞壁的伸展，廣泛參與植物根系的形態(tài)建成及生長發(fā)育[12-14]。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當 TaEXPB23基因在煙草中過表達時，可改變煙草幼苗根系的生長狀況；陳 琰等[16]發(fā)現(xiàn) TaEXPB8基因在小麥初生根的伸長區(qū)表達量最高；林 展等[17]在小麥品種3338中，成功克隆了18個膨脹素基因，其中， TaEXPA4、 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA8基因在根中特異性表達。俞志明等[18]認為 EXPA7基因亞家族成員都含有根毛特異性元件，一般會在根毛細胞中特異性表達。當植物處于逆境時，會通過增加擴展蛋白的積累量調(diào)節(jié)細胞壁的柔韌性，進而適應(yīng)脅迫[19]。雖然目前有關(guān)低溫脅迫冬小麥生長的抗凍生理研究[20-22]及激素含量的變化影響冬小麥抗寒性的研究[21-25]已有不少進展，但有關(guān)冬小麥在極度低溫和溫度變化較快的環(huán)境下根系形態(tài)建成的調(diào)控機制還不清楚。因此，本研究以經(jīng)不同低溫處理的東農(nóng)冬麥1號為試驗材料，分析低溫對該小麥中編碼EXPA的 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因相對表達量的影響，以期為后續(xù)研究與根系建成密切相關(guān)的膨脹素基因提供新的思路。

1　材料與方法

1.1試驗材料及其處理

高抗寒的冬小麥東農(nóng)冬麥1號(Ⅰ級)為試驗材料，正常的冬小麥濟麥22號 (Ⅳ級)為對照材料，均由東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院小麥育種研究室提供。

東農(nóng)冬麥1號和濟麥22的種子經(jīng)溫水浸泡露白后，以行距為3 cm、株距為3 cm播種于苗缽中，出苗前培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為：光照 12 h、20 ℃，黑暗12 h、18 ℃，相對濕度70%；出苗50%后培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為：光照12 h、25 ℃，黑暗12 h、18 ℃，相對濕度70%。待植株長至三葉一心期時，選取長勢一致的幼苗，分別在4 ℃、-10 ℃和-20 ℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h，再置于室溫恢復(fù)0、6、12、24、36和48 h，而溫度對照材料則一直置于25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境也均設(shè)置為：光照12 h/黑暗12 h。待處理完后，參照關(guān) 濤等[26]的取樣方法，每個處理隨機選取15株幼苗，用雙蒸水洗凈后剪下小麥根，分別稱量0.2 g，3次重復(fù)，用錫箔紙迅速包好，液氮迅速冷凍后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA的提取及cDNA的合成

使用天澤基因工程有限公司的植物RNA試劑盒(CAT#3080)提取總RNA。參考王 杰等[27]和白云鳳等[28]的研究方法，使用UV-240紫外分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度，OD260/OD280=1.8～2.1，且OD260/OD230>2.0，濃度不小于500 ng·μL-1。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。將符合標準的RNA使用?；锟萍加邢薰镜腞T-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat.No.D0501)進行第一鏈cDNA的合成。

1.3實時定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析

參照林 展等[17]的研究，應(yīng)用Primer Premire 5.0設(shè)計EXPA家族 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的qRT-PCR引物(表1)。對1.2中得到的各處理cDNA進行梯度稀釋，根據(jù)Ct值確定最佳反應(yīng)濃度。以確定好的最佳濃度的cDNA為模板，以小麥肌動蛋白基因β-actin為內(nèi)參，采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(AQ131)進行qRT-PCR分析。3次重復(fù)。反應(yīng)體系(20 μL)：2×Trans Star○RTop Green qPCR Super Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)在實時定量PCR儀(FQD-9620)上進行，反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，60 ℃時進行熒光信號的采集，反應(yīng)完成后繪制融解曲線。采用比較Ct法(△△Ct)對熒光定量PCR的擴增數(shù)據(jù)進行處理，用2-△△Ct法計算相對表達量，采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行方差及顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同低溫處理下 TaEXPA5基因的表達

采用不同低溫處理三葉期小麥幼苗，對其升至室溫后根中 TaEXPA5基因的相對表達量進行分析，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，在不同低溫處理下，東農(nóng)冬麥1號的處理組與自身材料的對照組相比， TaEXPA5基因相對表達量都明顯偏高，且東農(nóng)冬麥1號的處理組與濟麥22號的處理組相比，相對表達量呈現(xiàn)穩(wěn)定性變化，在-20 ℃處理時，濟麥22號 TaEXPA5基因的相對表達量逐漸降低，并且未出現(xiàn)穩(wěn)定性恢復(fù)的狀態(tài)，推測東農(nóng)冬麥1號 可能因為 TaEXPA5基因的表達使其適應(yīng)低溫脅迫。東農(nóng)冬麥1號在4 ℃處理時(圖1a)，升至室溫后根中 TaEXPA5基因的相對表達上升幅度較小，推測 TaEXPA5基因表達受4 ℃低溫處理的影響最?。欢?10 ℃(圖1b)和-20 ℃(圖1c)處理時，升至室溫后根中 TaEXPA5基因的相對表達量呈現(xiàn)顯著性升高的趨勢，分別在36 h、24 h時表達量達到最大值，推測 TaEXPA5基因可能會在-10 ℃和-20 ℃條件下被誘導(dǎo)，與其抗御低溫具有相關(guān)性。

表1　qRT-PCR分析所用引物Table 1　Primers used for qRT-PCR

2.2不同低溫處理下 TaEXPA6基因的表達

采用不同低溫處理三葉期小麥幼苗，對其升至室溫后根中 TaEXPA6基因的相對表達量進行分析，結(jié)果(圖2)表明，在不同低溫處理下，東農(nóng)冬麥1號的處理組與自身材料的對照組相比， TaEXPA6基因相對表達量基本上都明顯偏高，且東農(nóng)冬麥1號的處理組與濟麥22號的處理組相比，相對表達量呈現(xiàn)穩(wěn)定性變化，在-20 ℃時，濟麥22號中 TaEXPA6基因的相對表達量逐漸降低，并且未出現(xiàn)穩(wěn)定性恢復(fù)的狀態(tài)，推測東農(nóng)冬麥1號能抵御低溫的脅迫，可能與 TaEXPA6基因的表達有關(guān)。東農(nóng)冬麥1號在4 ℃(圖2a)處理時，升至室溫后根中 TaEXPA6基因的相對表達量呈現(xiàn)顯著性升高的趨勢，在48 h表達量達到最大值，而-10 ℃(圖2b)和-20 ℃(圖2c)處理時，升至室溫后根中 TaEXPA6基因的相對表達上升幅度較小，說明 TaEXPA6基因的表達可能受到4 ℃低溫處理的誘導(dǎo)。

a:4 ℃處理；b：-10 ℃處理；c:-20 ℃處理；A：東農(nóng)冬麥1號處理組；A1：東農(nóng)冬麥1號對照組；B：濟麥22號處理組；B1：濟麥22對照組；*和**分別表示室溫恢復(fù)一段時間后的相對表達量與室溫恢復(fù)0 h的相對表達量在0.05和0.01水平上差異顯著。下同。

a:Treatment under 4 ℃; b:Treatment under -10 ℃; c:Treatment under -20 ℃; A:Dongnongdongmai 1 under low temperature treatment; A1:Dongnongdongmai 1 without treatment; B:Jimai 22 under low temperature treatment; B1:Jimai 22 without treatment; * and ** indicate significant difference between the relative expression ofEXPAgene in the material recovering for a period at room temperature and the relative expression ofEXPAgene in the same material recovering for 0 h at room temperature at 0.05 and 0.01 levels,respectively.The same as below.

圖1不同溫度處理下 TaEXPA5基因的相對表達量

Fig.1Relative expression of TaEXPA5 gene under the treatments of different temperature

2.3不同低溫處理下 TaEXPA7基因的表達

采用不同低溫處理三葉期小麥幼苗，對其升至室溫后根中 TaEXPA7基因的相對表達量進行分析，結(jié)果(圖3)表明，在不同低溫處理下，東農(nóng)冬麥1號的處理組與自身材料的對照組相比， TaEXPA7基因相對表達量基本上都明顯偏高，且東農(nóng)冬麥1號的處理組與濟麥22號的處理組相比，相對表達量呈現(xiàn)穩(wěn)定性變化，在-20 ℃時，濟麥22號 TaEXPA7基因的相對表達量逐漸降低，并且未出現(xiàn)穩(wěn)定性恢復(fù)的狀態(tài)，推測可能由于 TaEXPA7基因的存在使東農(nóng)冬麥1號具有較強的抗寒性。東農(nóng)冬麥1號在-10 ℃(圖1b)處理時，升至室溫后根中 TaEXPA7基因的相對表達上升幅度較小，隨恢復(fù)期時間的延長，變化量幾乎不變趨于平穩(wěn)狀態(tài)，而4 ℃(圖1a)和-20 ℃(圖1c)處理時，升至室溫后根中 TaEXPA7基因的相對表達量呈現(xiàn)顯著性升高的趨勢，分別在24 h、48 h表達量達到最大值，說明 TaEXPA7基因的表達受到-10 ℃低溫處理的影響最小，而4 ℃和-20 ℃的溫度處理會誘導(dǎo) TaEXPA7基因的表達。

圖2　不同溫度處理下 TaEXPA6基因的相對表達量

3　討 論

寒害是影響高寒地區(qū)冬小麥種植的主要因素，因此研究抗寒基因的表達對高寒地區(qū)尤為重要。研究表明，低溫脅迫促使植物體內(nèi)積累或合成大量蛋白及參與應(yīng)激耐受性相關(guān)的小分子來抵御低溫，但不同品種的冬小麥抗寒性差異顯著[29-30]。本研究通過對冬小麥不同品種的三個基因研究顯示，不同低溫處理下，高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號的處理組與自身材料的對照組及正常冬小麥濟麥22號的對照組相比，基因相對表達量呈明顯上升趨勢，推測高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號可在黑龍江地區(qū)種植與該植物中存在 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因密切相關(guān)，三個基因相對表量的大小可能與其抗御低溫脅迫的能力呈 現(xiàn)正相關(guān)。同時，發(fā)現(xiàn)三個基因相對表達量達到最高值時時間點不同，推測各基因間的表達存在一定的協(xié)作性，與Liu等[31]、Wu等[32]和Palapol等[33]有關(guān)基因之間共同發(fā)揮作用調(diào)控植物生長發(fā)育的研究進程一致。

圖3　不同溫度處理下 TaEXPA7基因的相對表達量

本研究還得知，不同低溫處理，在相同抗寒性品種中相同膨脹素基因的相對表達量會存在差異；相同低溫處理，在不同抗寒性品種中相同膨脹素基因的相對表達量也不同，推測可能與 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因所行使的功能不同有關(guān)。但當植物伴隨著在室溫中恢復(fù)時間的延長，高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號基因的相對表達量均發(fā)生穩(wěn)定性恢復(fù)。陳儒鋼等[34]研究也表明，在基因表達受到脅迫時，基因表達量會升高，但當?shù)蜏孛{迫時間延長時，基因的表達量會急劇下降，在恢復(fù)期逐漸恢復(fù)正常。但在-20 ℃處理條件下，在對照材料正常冬小麥濟麥22號中發(fā)現(xiàn)當室溫恢復(fù)48 h時， TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的相對表達量會突然下降，且并未表現(xiàn)恢復(fù)生長的狀態(tài)，推測可能在極度低溫條件下，高抗寒冬小麥可能因為 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的快速表達從而抵御低溫的脅迫而成功越冬；正常冬小麥在受到低溫脅迫時，EXPA基因尚未快速表達，從而影響正常冬小麥的生長機制導(dǎo)致不能成功完成越冬返青。

王曉楠等[22]研究發(fā)現(xiàn)，分蘗節(jié)和根系的損害程度決定冬小麥能否成功越冬返青，發(fā)達的根系和健壯的分蘗節(jié)有利于冬小麥成功越冬。在研究激素處理擬南芥根系實驗中，Cho等[35]和Lin等[36]發(fā)現(xiàn)，當在根中 AtEXP7基因轉(zhuǎn)錄水平提高7倍時，根毛生長區(qū)表皮細胞所占總表皮細胞數(shù)的比例增加了約38%。而生長區(qū)是根系生長的主要區(qū)域，對高寒地區(qū)冬小麥的成活有著重要影響。本實驗中，當?shù)蜏靥幚矶←湑r，高抗寒冬小麥東農(nóng)冬麥1號中編碼EXPA的三個基因的相對表達量與自身材料的對照組及正常冬小麥濟麥22號的對照組相比呈現(xiàn)顯著性上升，猜測在低溫處理下，根中編碼EXPA的三個基因相對表達量的提高，可能會使根毛生長區(qū)表皮細胞增多，從而降低根系在寒冷情況下的受損情況。高抗寒的冬小麥東農(nóng)冬麥1號在高寒地區(qū)能夠成功越冬，猜測離不開 TaEXPA5、 TaEXPA6和 TaEXPA7基因的相互作用，三個基因可能參與低溫脅迫下植物根系的形態(tài)建成，成功完成冬小麥在高寒地區(qū)的越冬返青。但是，目前對于EXPA基因表達是如何調(diào)控根系生長的，以及與冬小麥抗寒之間的作用機理還有待于進一步研究。

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Expression Analysis ofEXPAGene in Root Tissues of Winter Wheat Dongnongdongmai 1 under Low Temperature Treatment

LI Fei1,WANG Xiaolei2,XU Yongqing1,ZHANG Junfeng1,DONG Jiamin1,MIAO Yu1,FENG Xu1,LI Fenglan1,HU Baozhong1，2

(1.College of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China;2.Harbin University,Harbin,Heilongjiang 150086,China)

The expression characteristics of expansin genes in winter wheat in cold region are closely associated with the establishment of root system. Thus,forming developed root system is crucial for winter wheat to overwinter and return green successfully in cold region. In order to investigate the effect of low temperature on the expression characteristics of expansin genes in winter wheat and enhance its adaptation in chilling condition,in this study,the expression characteristics of seedling root tissues TaEXPA5， TaEXPA6 and TaEXPA7 genes were analyzed in different low temperature by quantitative real-time PCR with the cold-resistance variety Dongnongdongmai 1 as experiment material and cold-sensitive variety Jimai 22 as control. The results showed that compared with control sample,the expression of TaEXPA5, TaEXPA6 and TaEXPA7 genes in Dongnongdongmai 1 was significantly higher under 4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃,respectively. The relative expression of TaEXPA6 and TaEXPA7 genes changed distinctly under 4 ℃. Similarly,under the treatment of -10 ℃,the variation of TaEXPA5 expression was definitely large. At the meanwhile,the relative expression of TaEXPA5 and TaEXPA7 genes changed significantly under the treatment of -20 ℃. It indicates that low temperature has effect on the expression of TaEXPA5, TaEXPA6 and TaEXPA7 genes in root tissues of winter wheat. These three genes are correlated to resist the low temperature stress and there exists certain cooperation among the expression of the three genes.

Low temperature; Winter wheat with high cold resistance; EXPA; Quantitative real-time PCR

2016-02-26

2016-05-25

國家基礎(chǔ)科學人才培養(yǎng)基金項目(J1210069)；中俄國際合作項目(2013DFR30270)

E-mail:1083660391@qq.com

李鳳蘭(E-mail:lifenglan@neau.edu.cn)；胡寶忠(E-mail:bzhu@neau.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)09-1159-08

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160831.1649.012.html