李昊，郭虎，王春生，宋紅衛(wèi)，樸善花，安鐵洙

?

綿羊基因啟動子序列的克隆及其與豬和牛序列的比較分析

李昊，郭虎，王春生，宋紅衛(wèi)，樸善花，安鐵洙*

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

為探明綿羊基因啟動子的結(jié)構(gòu)特點，用PCR方法克隆獲得了綿羊基因啟動子，并對綿羊、牛和豬基因的上游調(diào)控序列進(jìn)行對比分析。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增獲得長度為2 951 bp的綿羊基因啟動子；綿羊、牛和豬基因的上游調(diào)控序列均含有4個保守區(qū)域(CR1–CR4)，且4個保守區(qū)域在3個物種間具有高度同源性；CR1區(qū)域富含GC堿基對，且序列上的Sp1/Sp3位點與激素反應(yīng)元件HRE在3個物種中具有100%的同源性；綿羊和牛、豬的上游調(diào)控序列富含GC，并存在大量的CCC(A/T)CCC位點。

綿羊；牛；豬；基因啟動子；序列分析

Oct4(POU5f1)是動物種系之間具有高度保守性的POU轉(zhuǎn)錄因子，是迄今發(fā)現(xiàn)的最早也是最重要的維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新的關(guān)鍵因子。近年來，研究人員相繼對小鼠、豬和牛等的基因進(jìn)行了克隆，并對基因的調(diào)控序列進(jìn)行了深入研究。研究結(jié)果顯示，基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控涉及啟動子和上游2個增強(qiáng)元件，即近端增強(qiáng)子(proximal enhancer，PE)和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子(distal enhancer，DE)[1–2]；基因在小鼠、人和牛這3物種間具有高度保守性[3–5]，但迄今尚少見到有關(guān)綿羊基因的相關(guān)報道。筆者在擴(kuò)增綿羊基因啟動子的基礎(chǔ)上對啟動子序列進(jìn)行了分析，并將綿羊基因啟動子的序列與牛和豬的基因同源序列的上游區(qū)域進(jìn)行比較，以探明綿羊基因啟動子的結(jié)構(gòu)特點，建立完善的綿羊iPS誘導(dǎo)方法，為研究家畜基因的表達(dá)提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑和載體及菌株

全基因組DNA提取試劑盒(TAKARA公司)、pMD18–T載體及T4連接酶(TAKARA公司)、Trans5α型感受態(tài)細(xì)胞(TransGen公司)、小型質(zhì)粒提取試劑盒(BioTeke公司)、膠回收試劑盒(OMEGA)、I酶、HI酶和LA Premix酶均購自大連寶生物(TAKARA)工程有限公司，其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1綿羊基因組DNA的提取

取成年東北細(xì)毛羊肌肉組織，采用全基因組DNA提取試劑盒提取綿羊基因組DNA，并置于–20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2啟動子核心功能區(qū)的擴(kuò)增

引物的設(shè)計及合成：在比對GenBank中的人、鼠、兔和牛的啟動子的基礎(chǔ)上，依據(jù)啟動子序列在不同物種間的保守特性設(shè)計2對引物，即SPOct4–1(5–CATATGAAGGGTTGAGCACTTG TTT–3)、SPOct4–2(5–GGATCCCACTAGCCTTGA CCTCTGG–3)和SPOct4–3(5–CCAAGTAGCTCAA GCGATAA–3)、SPOct4–4(5–TAACCCTAAACAA GTGCTCAAC–3)。將設(shè)計的引物序列送寶生物(大連)有限公司進(jìn)行合成。合成的引物稀釋后–20 ℃保存，用于后續(xù)試驗。

基因啟動子擴(kuò)增：以綿羊基因組為模板，分別以SPOct4–1/ SPOct4–2和 SPOct4–3/SPOct4–4為引物對綿羊基因啟動子進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。以SPOct4–1/SPOct4–2為引物的PCR擴(kuò)增：PCR退火溫度分別設(shè)定為51.9、54.0、56.3、58.3、59.9 ℃；PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，10× rBuffer 2.5 μL，引物SPOct4–1和SPOct4–2各1.5 μL，r酶0.3 μL，最后添加ddH2O至25 μL；PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50~60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

以SPOct4–3/SPOct4–4為引物的PCR擴(kuò)增：PCR退火溫度分別設(shè)定為54.0、56.0、58.0、60.0、62.0、64.0 ℃；PCR反應(yīng)體系25 μL，其中DNA模板2 μL(100 nmol/L)，引物SPOct4–3和SPOct4–4各2 μL，LA Premix連接酶12.5 μL，ddH2O補(bǔ)齊至25 μL；PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，50~65 ℃退火30 s，72 ℃延伸125 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3pMD18–T–SPOct4重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述2組PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA片段膠回收試劑盒回收SPOct4–A和SPOct4–B基因片段，然后分別與pMD18–T載體在16 ℃條件下連接4 h(PCR產(chǎn)物7.5 μL，pMD18–T載體1 μL，Buffer 1.0 μL，T4連接酶0.5 μL)。取50 μL Trans5α型感受態(tài)細(xì)胞，加入5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白色克隆于含有氨芐西林(Amp)的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和I和HI雙酶切鑒定。將經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測序。

1.3序列對比分析

將獲得的綿羊啟動子與牛和豬的基因啟動子序列進(jìn)行比較，去除部分重疊序列后合并得到綿羊基因啟動子序列；利用DNAman軟件，將獲得的綿羊基因啟動子序列與GenBank中牛(序列號為AF022986)和豬(序列號為CT737281)的基因啟動子上游序列進(jìn)行對比，分析綿羊啟動子的相關(guān)調(diào)控位點、啟動子保守序列(CR)、啟動子的功能域及GC堿基對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1綿羊基因啟動子的克隆

以SPOct4–1/SPOct4–2為引物，對綿羊基因片段SPOct4–A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 200 bp處觀察到目的條帶(圖1)；以SPOct4–3/SPOct4–4為引物，對綿羊基因片段SPOct4–B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后，在約1 850 bp處觀察到目的條帶(圖2)。

1、2、4、5、6分別為退火溫度51.9、54.0、56.3、58.3、59.9 ℃時的電泳結(jié)果；3　Marker III核酸標(biāo)記物。

1　DL 2000核酸標(biāo)記物；2、3、4、5、6、7分別為退火溫度54.0、56.0、58.0、60.0、62.0、64.0 ℃時的電泳結(jié)果；8　陰性對照。

2.2綿羊基因啟動子克隆載體的鑒定

1　陰性對照；2　PCR電泳條帶；3　NdeI和BamHI雙酶切產(chǎn)物電泳條帶；4　Marker III核酸標(biāo)記物。

1　DL 2 000核酸標(biāo)記物；2　重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳條帶；3　陰性對照。

1　DL 2 000核酸標(biāo)記物；2　NdeI和BamHI雙酶切產(chǎn)物電泳條帶。

2.3綿羊啟動子的相關(guān)調(diào)控位點分析

利用Primer 5.0對獲得的綿羊基因啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在克隆獲得的綿羊基因啟動子的804、1 181、1 959位點有3個CAAT box，但沒有TATA box；在2 835位點含有1個GC_SP1序列或SP1序列。此外，序列中還包含一些其他與調(diào)控相關(guān)的功能區(qū)段(表1)。所獲得的綿羊基因啟動子與牛的基因啟動子有92.46%的同源性。

表1　綿羊Oct4基因啟動子上的調(diào)控位點信息

2.4綿羊、牛和豬的啟動子保守區(qū)定位與同源性分析

將獲得的綿羊基因啟動子序列與牛和豬的基因啟動子序列進(jìn)行比較，分析結(jié)果顯示：綿羊、牛和豬均含有4個保守區(qū)域，即CR1、CR2、CR3和CR4；CR1(基因啟動子最近端保守區(qū)域)在綿羊、牛和豬的中均對應(yīng)于上游序列–130/–1的核苷酸位置；CR2在綿羊、牛和豬上游序列上分別位于–1 467/–1 167、–1 455/–1 168和–1 229/–947，三者間具有高度的同源性(表2)；綿羊、牛和豬的CR3分別位于上游區(qū)域–1 956/–1 852、–1 769/–1 663和–1 393/–1 289，三者間同樣具有高度的同源性(表2)；綿羊、牛和豬的啟動子的CR4分別位于基因啟動子5序列的–2 557/–2 426、–2 361/–2 229和–2 096/–1 966。綿羊和牛、牛和豬、綿羊和豬之間的同源性分別為94.03%、88.81%和93.28%(表2)；圖6結(jié)果顯示，綿羊和牛的CR1、CR2、CR3區(qū)域與CR4區(qū)域接近重合，綿羊豬的CR1區(qū)域完全重合，CR2區(qū)域與CR4區(qū)域部分重合，而二者的CR3區(qū)域不重合。

表2　綿羊、牛和豬各保守區(qū)域的相同堿基數(shù)及同源性對比結(jié)果

圖6　綿羊、牛和豬的Oct4基因5'上游保守區(qū)域(CR)示意圖

2.5綿羊、牛和豬啟動子保守區(qū)調(diào)控基序分析

對3個物種保守區(qū)域(CR)的調(diào)控基序進(jìn)行比較，其結(jié)果顯示，在綿羊、牛和豬的CR1中的Sp1/Sp3結(jié)合位點(5–GGGGGCGGGG–3)和與之重疊的HRE(5–GGGCCAGAGGTCAAGGCTA–3)具有100%的同源性，且5–GGGTGGG–3和5–GGGA GGG–3具有極高的保守性，并且有2個CCC(A/T) CCC序列定位在CR1上(圖7)；綿羊、牛和豬的CR2和CR3均位于GC富含區(qū)，其中，CR2含有1個保守的5–CCCTCCC–3序列(綿羊的是–1 205/–1 199) (圖7)；綿羊、牛和豬的CR4區(qū)域包含1個部分保守的5–CCCTCCC–3的序列(綿羊的是–2 351/– 2 344)和1個保守的5–GGGAGGG–3序列(綿羊的是–2 250/–2 244)(圖7)。

圖7　綿羊、牛和豬的保守區(qū)域(CR)序列對比

2.6綿羊、牛和豬5區(qū)域中GC堿基對含量的比較

當(dāng)前基礎(chǔ)工程建設(shè)的步伐逐漸加快，在電力系統(tǒng)運(yùn)行管理中，電力電纜的鋪設(shè)工作很重要，在日后電力電纜管理中，必須合理操作，減少異常影響。但是現(xiàn)階段電力電纜鋪設(shè)的過程中存在很多問題和弊端，操作人員可能存在失誤，對各種問題缺少了解。此外在責(zé)任和態(tài)度上，施工人員對電力電纜進(jìn)行預(yù)設(shè)的過程中，沒有對圖紙進(jìn)行認(rèn)真的分析和考量，僅是簡單的進(jìn)行處理。施工現(xiàn)場可能存在不同程度的隱患。如果摩擦現(xiàn)象嚴(yán)重，不能盡快處理，可能存在摩擦性的異常影響。由于破損面的擴(kuò)散和物質(zhì)侵蝕后，對電力電纜本身容易造成腐蝕，如果系統(tǒng)存在故障或者崩潰等現(xiàn)象，直接對應(yīng)用效果，產(chǎn)生影響。

對所擴(kuò)增的綿羊5區(qū)域的測序結(jié)果顯示，綿羊5區(qū)域由2 951個核苷酸序列構(gòu)成(牛和豬分別為2 955、2 734個)，G+C堿基對的比例為56.5% (牛和豬的分別為56.35%和58.7%)，其中，富含G+C堿基對的片段位于?3 063/?2 755、?2 632/?2 393、?2 184/ ?1 907、?1 753/?1 116和?264/?1(G+C堿基對分別占63.6%、60.4%、60.1%、60.0%和64.0%；牛的富含G+C堿基對的片段位于–2 763/–2 546；–2 457/–2 198、–1 645/–1 302、–435/–1 G+C堿基對占相應(yīng)片段堿基對的比率分別為59.2%、60.0%、64.0%和65.3%)。表3結(jié)果顯示，綿羊、牛和豬的CR1、CR2、CR3、CR4中G+C堿基對所占比例非常接近。

表3　綿羊、牛和豬各保守區(qū)域中G+C的含量及其所占的比例

3　結(jié)論與討論

自Yamanaka等[6]利用Sox2、Oct4、Klf4和c–Myc因子誘導(dǎo)小鼠纖維細(xì)胞成為多能干細(xì)胞iPS以來，已采用相同或相近的方法相繼用小鼠神經(jīng)干細(xì)胞[7]、小鼠胰腺β細(xì)胞[8]和人皮膚成纖維細(xì)胞[9]等多種體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞。在誘導(dǎo)iPS過程中，作為不可或缺的誘導(dǎo)因子而備受關(guān)注。在研究基因表達(dá)和調(diào)控的過程中，通常會對基因的啟動子序列進(jìn)行克隆并進(jìn)行活性檢測[10]，還會利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行序列比對、同源性分析和對序列在不同物種間的保守性進(jìn)行分析[11]。目前，小鼠、人和豬等的基因已被成功克隆，并已利用其因子相繼建立獲得iPS的方法。根據(jù)蛋白序列同源性、外顯子組成以及主要組織相容性復(fù)合物的研究結(jié)果，基因啟動子在小鼠、人和牛這3種物種間具有高度保守性[3–5]，但迄今尚少見到有關(guān)綿羊基因的相關(guān)報道。以往，在誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞為iPS的研究過程中主要是利用來源于其他物種的等誘導(dǎo)因子[12–13]。本研究中，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了綿羊基因啟動子序列，在此基礎(chǔ)上與牛和豬的啟動子序列進(jìn)行了比較，其結(jié)果表明，綿羊和牛的啟動子序列的同源性達(dá)92.46%。此外，綿羊、牛和豬啟動子保守區(qū)域CR1、CR2、CR3和CR4在上游序列中近乎在相近的核苷酸位置上，且具有高度的同源性。上述結(jié)果顯示，綿羊基因啟動子與牛和豬具有核苷酸序列的保守性，這種特性可能是異源誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)綿羊體細(xì)胞為iPS的基礎(chǔ)。

有關(guān)小鼠基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列中的啟動子序列、增強(qiáng)元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已比較清楚[1,2,14–19]?，F(xiàn)有研究已證實，小鼠與人和牛基因上游序列轉(zhuǎn)錄起始位點的上游區(qū)域均存在1個GC框，可以與Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，以調(diào)節(jié)未分化細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄起始，與GC框重疊的是1個與視黃酸反應(yīng)元件RARE相似的位點，被稱為HRE位點。HRE位點在視黃酸(RA)誘導(dǎo)的下調(diào)過程中起重要作用[20]。作為反式阻遏蛋白的孤兒核激素受體雖然能與啟動子結(jié)合，但由于其表達(dá)過晚而未能參與到RA誘導(dǎo)基因的下調(diào)過程[15–16]。在基因上游區(qū)域還存在一些CCCACCC, GGGTGGG, CCCTCCC和GGGAGGG序列，對此統(tǒng)稱為CCC(A/T)CCC位點，基因印記分析結(jié)果表明，這些位點對于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)具有重要作用[19]。本研究中，對所獲得的綿羊啟動子序列的分析結(jié)果顯示，基因 5端上游序列中保守區(qū)域CR1在綿羊、牛和豬的中均對應(yīng)于上游序列–130/–1的核苷酸位置，其中，Sp1/Sp3結(jié)合位點(5–GGGGGCGGGG–3)和與之重疊的HRE(5–GGGCCAGAGGTCAAGGCTA–3)在3個物種中具有100%的同源性，在CR1上有2處CCC(A/T)CCC序列定位；此外，5–GGGTGGG–3和5–GGGAGGG–3在綿羊、牛和豬中均為保守。上述結(jié)果表明，綿羊基因表達(dá)可能具有與小鼠、人、牛和豬等相似的調(diào)控機(jī)制。

已有大量研究證實，某些基因中特異核苷酸發(fā)生甲基化或去甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制，在此過程中，甲基化變化主要在GC富含區(qū)的胞嘧啶(C)。據(jù)Imamura等[21]的研究表明，在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞發(fā)生分化的過程中，其細(xì)胞的啟動子序列發(fā)生廣泛的甲基化。另據(jù)Okita等[22]的研究表明，在體細(xì)胞重編程為iPS過程中，其啟動子的GC富含區(qū)發(fā)生廣泛的去甲基化。上述結(jié)果表明，啟動子GC富含區(qū)的甲基化狀態(tài)是細(xì)胞維持亞全能性或分化的重要標(biāo)志。為了了解綿羊啟動子序列中是否可能發(fā)生甲基化變化區(qū)域，本研究中對所獲得的綿羊啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，綿羊5區(qū)域的核苷酸量、G+C堿基對比例、富含G+C堿基對片段的位置及其4個啟動子保守區(qū)域CR中的G+C堿基對含量具有極高的保守性。上述結(jié)果表明，綿羊基因表達(dá)調(diào)控過程中啟動子甲基化的變化模式可能與牛和豬等物種的相似。

參考文獻(xiàn)：

[1] Okazawa H，Okamoto K，Ishino F，et al．Thegene，a gene for an embryonic transcription factor，is controlled by a retinoic acid repressible enhancer[J]．EMBO J，1991，10(10)：2997–3005．

[2] Yeom Y I，F(xiàn)uhrmann G，Ovitt C E，et al．Germline regulatory element ofspecific for the totipotent cycle of embryonal cells[J]．Development，1996，122(3)：881–894．

[3] Takeda J，Seino S，Bell G I．Humangene family：cDNA sequences，alternative splicing，gene organization，chromosomal location，and expression at low levels in adult tissues[J]．Nucl Acids Res，1992，20(17)：4613–4620．DOI:10.1093/nar/20.17.4613．

[4] Abdel-Rahman B，F(xiàn)iddler M，Rappolee D，et al. Expression of transcription regulating genes in human preimplantation embryos[J]．Hum Reprod，1995，10(10)：2787–2792．DOI:10.1093/molehr/1.8.401．

[5] van Eijk M J，van Rooijen M A，Modina S，et al. Molecular cloning，genetic mapping，and developmental expression of bovine POU5F1[J]．Biol Reprod，1999，60(5)：1093–1103．DOI:10.1095/biolreprod60.5.1093．

[6] Takahashi K，Yamanaka S．Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]．Cell，2006，126(4)：663–676. DOI:10.1016/j.cell.2006.07.024．

[7] Shi Y，Do J T，Desponts C，et al．A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells[J]．Cell Stem Cell，2008，2(6)：525–528．DOI:10.1016/j.stem.2008.05.011．

[8] Lewitzky M，Yamanaka S．Reprogramming somatic cells towards pluripotency by defined factors[J]．Curr Opin Biotechnol，2007，18(5)：467–473．DOI:10.1016/j.copbio. 2007.09.007．

[9] Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al．Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors[J]．Cell，2007，131(5)：861–872．DOI:10. 1016/j.cell.2007.11.019．

[10] 黃真池，盧向陽，曾富華，等．受病原物誘導(dǎo)的植物啟動子PPPs在轉(zhuǎn)基因辣椒中的活性[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，34(3)：270–273．

[11] 張偉，方梅霞，聶慶華，等．豬TDRP1基因的電子克隆及生物信息學(xué)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，36(6)：672–677．DOI:10.3724/SP.J.1238.2010. 00672．

[12] Bao L，He L，Chen J，et al．Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors[J]．Cell Res，2011，21(4)：600–608．DOI:10.1038/cr.2011.6．

[13] Li Y，Cang M，Lee AS，et al．Reprogramming of sheep fibroblasts into pluripotency under a drug-inducible expression of mouse-derived defined factors[J]．PLoS ONE，2011，6(1)：e15947．DOI:10.1371/journal.pone. 0015947．

[14] Pikarsky E，Sharir H，Ben-Shushan E，et al．Retinoic acid represses–gene expression through several retinoic acid-responsive elements located in the promoter- enhancer region[J]．Mol Cell Biol，1994，14(2)：1026–1038．DOI:10.1128/mcb.14.2.1026．

[15] Schoorlemmer J，van Puijenbroek A，van Den Eijnden M，et al．Characterization of a negative retinoic acid response element in the murinepromoter[J]．Mol Cell Biol，1994，14(2)：1122–1136．DOI:10.1128/mcb. 14.2.1122．

[16] Sylvester I，Sch?ler H R．Regulation of thegene by nuclear receptors[J]．Nucleic Acids Res，1994，22(6)：901–911．DOI:10.1093/nar/22.6.901．

[17] Ben–Shushan E，Sharir H，Pikarsky E，et al．A dynamic balance between ARP–1/COUP–TFII，EAR–3/COUP– TFI，and retinoic acid receptor：retinoid X receptor heterodimers regulates–expression in embryonal carcinoma cells[J]．Mol Cell Biol，1995，15(2)：1034– 1048．DOI:10.1128/mcb.15.2.1034．

[18] Barnea E，Bergman Y．Synergy of SF1 and RAR in activation of–promoter[J]．J Biol Chem，2000，275(9)：6608–6619．DOI:10.1074/jbc.275.9.6608．

[19] Minucci S，Botquin V，Yeom Y I，et al．Retinoic acid-mediated down-regulation of Oct3/4 coincides with the loss of promoter occupancy in vivo[J]．EMBO J，1996，15(4)：888–899．

[20] Imamura M，Miura K，Iwabuchi K，et al．Transcriptional repression and DNA hypermethylation of a small set of ES cell marker genes in male germline stem cells[J]．BMC Dev Biol，2006，6：34．DOI:10.1186/1471– 213X–6–34．

[21] Okita K，Ichisaka T，Yamanaka S．Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells[J]. Nature，2007，448(7151)：313–317．DOI:10.1038/nature 05934．

Cloning promoterfrom sheep and its sequence comparison with bovine and porcine upstream promoter sequences

Li Hao, Guo Hu, Wang Chunsheng, Song Hongwei, Piao Shanhua, An Tiezhu*

(College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040, China)

To explore the structural characteristics of gene promoterwere cloned using PCR, and the comparative alignment analysis among sheep, cow and pig was conducted as well. The results showed that the promoter was 2 951 bp in length. There were four conserved regions (CR 1 to 4) in theupstream regulatory sequence of genesheep, cow and pig, and the four regions presented in high homology among the three species. A putative Sp1/Sp3 binding site and the overlapping hormone responsive element (HRE) in CR 1 region were identical to each other among the three species, moreover, there were rich in GC and a high number of CCC (A/T) CCC motifs in the upstream regions. The research could provide reference for futher understanding the geneand facilitate the relevant research on sheep.

sheep; cow; pig; gene promoter; sequence analysis

S826.1

A

1007-1032(2016)05-0511-07

2015–12–09

2016–04–07

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項C類項目(2572016CA10)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C2016012)

李昊(1985—)，男，遼寧錦州人，博士研究生，主要從事動物轉(zhuǎn)基因研究，jayhaoli01@163.com；*通信作者，安鐵洙，教授，博士，主要從事動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，antiezhu@tom.com

投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王庫