馮秀燕，楊寶良，魏秀蓮，張亞君

（北京市飼料監(jiān)察所，北京朝陽100107）

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檢測(cè)分析

高效液相色譜紫外檢測(cè)法測(cè)定添加劑預(yù)混合飼料中葉酸含量

馮秀燕*，楊寶良，魏秀蓮，張亞君

（北京市飼料監(jiān)察所，北京朝陽100107）

本實(shí)驗(yàn)建立了添加劑預(yù)混合飼料中葉酸測(cè)定的高效液相色譜紫外檢測(cè)測(cè)定方法。樣品經(jīng)碳酸鈉溶液提取，通過陰離子交換柱凈化富集，高效液相色譜紫外法測(cè)定。結(jié)果表明：葉酸濃度為0.1～250.0 μg/mL時(shí)，具有良好的線性關(guān)系，樣品回收率為79.9%～100.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，定量限可達(dá)0.3 mg/kg，適用于添加劑預(yù)混合飼料中葉酸含量的測(cè)定。

飼料；葉酸；高效液相色譜法；測(cè)定

葉酸是B族維生素中的一員，在體內(nèi)被還原酶還原為四氫葉酸，成為多種代謝過程中的輔酶。葉酸的缺乏會(huì)影響動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能。葉酸缺乏時(shí)雛雞免疫力低下（牛發(fā)良等，2002）。研究表明補(bǔ)充葉酸可改善母豬繁殖性能，提高肉仔雞生產(chǎn)性能（丑武江等，2009）。目前，葉酸已經(jīng)成為現(xiàn)代飼料工業(yè)中是一種常用的保障動(dòng)物健康和良好生產(chǎn)性能的飼料添加劑。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜紫外檢測(cè)的方法，研究建立了適用于添加劑預(yù)混合飼料中葉酸含量測(cè)定的方法。

1　材料與方法

1.1儀器和設(shè)備高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器；分析天平：感量0.1 mg、感量0.01 mg；超聲波振蕩器；離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000 r/min；渦旋混合器；pH計(jì)：精度為0.01；0.22 μm微孔濾膜；固相萃取裝置；固相萃取柱：200 mg/6 mL，Bonel Elu+Plexa PAX或相當(dāng)者。

1.2試劑與溶液0.1 mol/L Na2CO3溶液、0.1 mol/L EDTA溶液、0.05 mol/L NaH2PO4溶液（pH= 6.30）、GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)用水，甲醇為色譜純，葉酸對(duì)照品純度大于97.4%。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取葉酸對(duì)照品12.5 mg左右，用0.1 mol/L Na2CO3溶液溶解，加入100 μg抗壞血酸并用水定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存，有效期為2個(gè)月。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取1.0 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至50 mL容量瓶中，稀釋成5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3測(cè)定方法

1.3.1提取準(zhǔn)確稱取添加劑預(yù)混合飼料試樣1 g（精確到0.0001 g）至50 mL離心管中，加入8 mL 0.1 mol/L EDTA溶液，渦旋混合2 min，加入25 mL甲醇，渦旋均勻混合2 min，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，再加入10 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液，蒸餾水定容至50 mL。超聲提取15 min后，取20 mL樣液于50 mL離心管，10000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確移取上清液10.0 mL于15 mL離心管中，在40℃下氮?dú)獯抵?.5 mL（維生素預(yù)混合飼料可以不經(jīng)過凈化過程直接過0.22 μm濾膜上機(jī)）。

1.3.2凈化PAX固相萃取小柱先用5 mL甲醇活化，再用5 mL水進(jìn)行平衡后，移取全部6.5 mL備用液過柱。取5 mL水沖洗盛放上清液的離心管，充分轉(zhuǎn)移至萃取柱中淋洗，再用5 mL甲醇淋洗，抽干5 min，用6 mL洗脫液，每次2 mL分3次洗脫，流速控制在1 mL/min，收集洗脫液；洗脫液在40℃下氮?dú)獯抵?.0 mL以下，向殘余物中加水定容至1.0 mL，超聲2 min，混勻后過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3.3液相色譜參考條件色譜柱為耐堿性C18柱（可耐受pH值10）：柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑2.7 μm或相當(dāng)者。柱溫為30℃。檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為5～10 μL。

流動(dòng)相：A相為0.05 moL/L磷酸二氫鈉（pH= 6.30）；B相為甲醇。梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.3.4定量測(cè)定在儀器正常工作條件下，分別注入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定。用液相色譜保留時(shí)間定性，用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液做單點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰的峰面積進(jìn)行定量計(jì)算，或者以標(biāo)準(zhǔn)工作液中被測(cè)組分峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)被測(cè)組分濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，用工作曲線對(duì)試樣進(jìn)行定量。試樣溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜圖葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 μg/mL）、空白飼料樣品及空白添加樣品的色譜圖見圖1～4。由色譜圖可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物葉酸有良好的分析效果，空白飼料及添加樣品無干擾。

圖1　葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.0 μg/mL）色譜圖

圖2　幾種水溶性維生素的混標(biāo)色譜圖

圖3　空白預(yù)混合飼料試樣色譜圖

圖4　預(yù)混合飼料試樣中添加0.3 μg/g葉酸色譜圖

2.2線性范圍、檢出限和定量限根據(jù)葉酸的添加范圍，配制了6個(gè)不同濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，分別為：0.1、0.5、2.5、10.0、25.0、250.0 μg/mL，在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下進(jìn)行分析，根據(jù)葉酸的濃度與峰面積的響應(yīng)值進(jìn)行分析。在0.1～250 μg/mL線性良好，線性回歸方程為：y=39.827x+5.4049，r=1.0000。添加1 μg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL于1.0 g空白飼料中（即添加濃度為0.1 mg/kg），經(jīng)提取后測(cè)定，葉酸的信噪比S/N＞3，表明方法的檢出限可達(dá)到0.1 mg/kg。添加1 μg/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 mL于1.0 g空白飼料中（即添加濃度為0.3 mg/kg），經(jīng)提取后測(cè)定，葉酸的信噪比S/N＞10（按PtP算），表明方法的定量限可達(dá)到0.3 mg/kg。對(duì)預(yù)混料進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，使其濃度為0.3 mg/kg。結(jié)果表明，在飼料中添加0.3 mg/kg的葉酸，回收率可達(dá)到79.9%，可以滿足測(cè)定的要求。因此，定量限可達(dá)0.3 mg/kg。

2.3準(zhǔn)確度和精密度以空白預(yù)混料為基礎(chǔ)進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度。由表2可知，每種飼料中葉酸添加3個(gè)濃度水平。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，計(jì)算添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)。在3個(gè)濃度添加水平下，平均回收率為79.9%～100.4%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度都符合檢測(cè)分析的要求。

表2　準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（n=5）

2.4色譜條件的確立根據(jù)葉酸的極性特點(diǎn)檢測(cè)多用反相色譜柱。選用了SB-C18和HPH-C18兩種進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SB-C18的分離效果雖然很好，但是相對(duì)于HPH-C18而言，其耐堿性能明顯要弱。在本方法的色譜條件下，使用壽命非常短。而HPH-C18色譜柱既很好地解決了耐堿問題，在分離效果上也能夠滿足要求。所以最終選擇了HPH-C18色譜柱。由圖5可知，根據(jù)葉酸在紫外區(qū)的吸收特點(diǎn)，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。進(jìn)樣量為5～10 μL。流速為1.0 mL/min。

圖5　葉酸光譜圖

2.5提取條件的確定葉酸易溶于弱堿性溶液而微溶于水。用0.1 moL/L的碳酸鈉溶液提取葉酸，發(fā)現(xiàn)葉酸回收率不是很高，主要源于飼料配方復(fù)雜，含多種基質(zhì)，微量元素中鐵、銅、鋅的存在也對(duì)葉酸的提取造成了一定的影響。根據(jù)這種情況從螯合金屬元素等方面入手，解決葉酸回收率低的問題。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究，稱取1 g試樣加入10 mL的EDTA可滿足檢測(cè)要求。通過上述研究，確定了本實(shí)驗(yàn)的提取條件。

2.6凈化條件的選擇目前SPE柱子廣泛應(yīng)用于各類分析，因此對(duì)不同種類、不同規(guī)格、不同廠家柱子的吸附能力進(jìn)行考察：waters公司C18柱；supelco公司C18柱；agilent公司的PAX柱。分別用5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接上柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)agilent公司的PAX柱回收率可達(dá)98%以上，因此選用PAX柱來做凈化，通過條件優(yōu)化確定了本實(shí)驗(yàn)的凈化條件。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜紫外檢測(cè)方法測(cè)定添加劑預(yù)混合飼料中的葉酸含量，方法的回收率和精密度能夠滿足檢測(cè)要求，并大大降低了方法的定量限，方法的定量限可達(dá)到0.3 mg/kg，回收率為79.9%～100.4%，適用于各種添加劑預(yù)混合飼料中葉酸的測(cè)定。

［1］丑武江，郭雄全，葛文霞.葉酸對(duì)肉仔雞蛋白質(zhì)及生產(chǎn)性能的影響研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)［J］.2009，46（5）：1140～1143

［2］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 17813-1999［S］.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—復(fù)合預(yù)混料中煙酸、葉酸的測(cè)定高效液相色譜法.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999-8-10.

［3］牛發(fā)良，侯亞利，秦秀麗，等.添加葉酸對(duì)雛雞免疫功能的作用及意義［J］.張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，19（3）：3～4.

［4］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.211-2008［S］.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)—食品中葉酸的測(cè)定.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008-11-21.

A high performance liquid chromatography（HPLC）method was developed for the determination of folic acid in feed additive premix.Sample was extracted by the solution of Na2CO3，and purified by ion exchange column.The results showed that：in the range of 0.1～250.0 μg/mL，there was a good linear correlation between the peak area and concentration of folic acid.The average recovery rates in feed were 79.9%～100.4%.The relative standard deviation was below 10%.The quantification limit was 0.3 mg/kg.It was a suitable method for determination of folic acid in feed additive premix.

feed；folic acid；high performance liquid chromatography；determination

S816.17

A

1004-3314（2016）07-0016-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160704