李貞
(內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系,內(nèi)蒙古呼和浩特010070)
ELISA方法檢測(cè)牛奶中葉酸含量
李貞
(內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系,內(nèi)蒙古呼和浩特010070)
探討牛奶中葉酸檢測(cè)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法建立及其葉酸本底含量測(cè)定。用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫,棋盤法確定最佳抗體包被條件、封閉條件、酶標(biāo)抗原濃度等,并進(jìn)行性能評(píng)價(jià)測(cè)定,檢測(cè)80例牛奶樣品中的葉酸本底含量。結(jié)果表明:①最佳ELISA條件為:葉酸抗體以2 μg/mL濃度,碳酸鹽緩沖液4℃過夜包被,用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉,葉酸-辣根過氧化物酶標(biāo)記物(葉酸-HRP)工作濃度1 μg/mL。②該方法最低檢測(cè)限2.22 ng/mL;精密度測(cè)試CV<5%;特異性檢測(cè)與葉酸類似物的交叉反應(yīng)率均≤0.1%;本方法與對(duì)照方法具有良好的樣本測(cè)值相關(guān)性(r=0.960,P<0.05);該方法加標(biāo)回收率在94.50%~108.00%之間,回收效果良好;樣品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)該方法測(cè)值無顯著影響。③牛奶樣本葉酸本底含量范圍為12.55 ng/mL~68.72 ng/mL,均值37.93 ng/mL。本研究建立的ELISA方法能夠滿足牛奶樣品中葉酸含量的檢測(cè)。
酶聯(lián)免疫法;葉酸;棋盤法
葉酸是一種水溶性B族維生素,在人體中發(fā)揮重要的生理作用如:參與脫氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)的合成,防止DNA的變異,預(yù)防癌癥[1];參與氨基酸的代謝,充當(dāng)甘氨酸與絲氨酸、組氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程中的一碳載體[2];參與血紅蛋白及甲基化合物如腎上腺素、膽堿、肌酸等的合成,是含鐵血紅蛋白的組分[3]。
葉酸對(duì)人體作用重大,但是人體自身不能合成葉酸,只能通過外界補(bǔ)充,因此食品中葉酸含量的高低直接影響著人體葉酸水平的高低。牛奶目前已經(jīng)成為民眾不可或缺的食品組成部分,因此其葉酸含量的檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)乳制品企業(yè)在合理范圍內(nèi)強(qiáng)化葉酸的添加量具有重大的意義。目前,牛奶中葉酸的檢測(cè)有很多方法[4]:如微生物法、化學(xué)發(fā)光測(cè)定法、離子捕獲法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、高效液相色譜法等,但都有其各自的缺陷,微生物法檢測(cè)周期長(zhǎng),菌種傳代保存比較繁瑣;化學(xué)發(fā)光法與熒光法對(duì)儀器要求較高;比色法和紫外分光光度法選擇性較差,容易被干擾;薄層層析法靈敏度較低,且只適合維生素制劑中葉酸的測(cè)定;高效液相色譜法靈敏度低,對(duì)儀器要求較高,樣本抗干擾能力差。
酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)具有檢驗(yàn)靈敏度高、特異性好、樣本處理量大、檢驗(yàn)時(shí)間短、儀器要求低等諸多優(yōu)點(diǎn),目前市場(chǎng)上幾乎沒有專門用于食品(牛奶)葉酸檢測(cè)的ELISA試劑盒,因此本研究旨在探討自主建立ELISA方法進(jìn)行牛奶中葉酸含量的檢測(cè)。
1.1材料
1.1.1主要試劑以及材料
酶標(biāo)板:Corning Incorporated(USA);葉酸標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma-Aldrich Co.LLC;葉酸單克隆抗體、葉酸-HRP:北京翰譜醫(yī)藥生物研究所;酶標(biāo)抗原稀釋液、TMB(四甲基聯(lián)苯胺)單組份顯色液:北京梅德厚普生物科技有限公司;清洗液(磷酸鹽緩沖液,20 mmol/L,pH 7.4)、終止液(0.5 mol/L硫酸)。
1.1.2主要儀器
洗板機(jī):普朗集團(tuán);酶標(biāo)儀:Thermo Multiskan。
1.2方法
1.2.1競(jìng)爭(zhēng)ELISA程序[5]
1)包被抗體:將抗體用包被緩沖液稀釋到一定濃度,100 μL/孔,37℃或者4℃包被若干小時(shí),洗板兩次。
2)封閉:每孔加入200 μL封閉液,37℃封閉2 h~4 h,洗板3次。
3)加樣:每孔加入樣品(標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品)50 μL以及稀釋的葉酸-HRP 50 μL,37℃反應(yīng)1 h,洗板5次。
4)顯色:每孔加入TMB單組份顯色底物100 μL,37℃反應(yīng)15 min。
5)終止讀數(shù):每孔加入終止液50 μL,酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù),記錄OD450nm。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備
電子天平準(zhǔn)確稱量50mg葉酸,倒入50mL容量瓶,用10mmol/LNaOH定容,搖勻溶解,此時(shí)濃度1mg/mL,移液器取上述液體1 mL放入1 L容量瓶,用生理鹽水稀釋至1 μg/mL,再繼續(xù)稀釋得到100、50、25、10、5、2.5 ng/mL以及0 ng/mL共7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品置于棕色瓶中儲(chǔ)存。
1.2.3樣品的制備
5 mL的新鮮牛奶樣品(全脂乳或脫脂乳)置于試管中,2℃~8℃冷藏30 min。隨后樣品在3 000 r/min條件下離心10 min。上部的脂肪層吸出并棄去。剩余的水層以1∶5的體積比稀釋于樣品稀釋液中。
1.2.4抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定
采用棋盤法[6],同時(shí)確定抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度,方法如下:抗體用pH=9.6的50 mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋,共4、2、1、0.5 μg/mL 4個(gè)梯度,4℃過夜包被,1%BSA封閉,然后每孔加入50 μL,濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,再分別加入的1、0.5、0.2 μg/mL 3個(gè)梯度的葉酸-HRP,37℃反應(yīng)1 h,顯色,終止讀數(shù)。選取OD450nm最接近2.0的抗體包被濃度與葉酸-HRP稀釋濃度作為最佳工作濃度。
1.2.5抗體包被條件的確定
選擇3種包被液:檸檬酸緩沖液(50 mmol/L,pH 5.0)、磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 7.4)、碳酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 9.6);兩種包被方式:37℃包被4 h、4℃過夜包被(12 h),按照1.2.4確定的最佳工作濃度試驗(yàn),比較各組陰陽(yáng)性對(duì)照孔OD450nm值和N/P比,以確定最佳包被條件。
1.2.6封閉劑的確定
選擇3種封閉液:1%BSA、1%明膠、5%的奶粉,按照1.2.4確定的最佳工作濃度與1.2.5確定的最佳包被條件進(jìn)行試驗(yàn),比較各組陰陽(yáng)性對(duì)照孔OD450nm值和N/P比,以確定最佳封閉條件。
1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
記標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x,記每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的OD450nm值為y,作x、y散點(diǎn)圖,采用合適的擬合方法進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,計(jì)算回歸方程以及回歸系數(shù)。
1.2.8本方法性能測(cè)定
1)最低檢測(cè)限:以0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為最低檢測(cè)限吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的濃度即為最低檢測(cè)限濃度。
2)精密度測(cè)試:定標(biāo)后平行測(cè)試高值與低值樣本各10次,計(jì)算測(cè)定均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)。按照公式(1)計(jì)算變異系數(shù)。3)特異性測(cè)定[7]:特異性可用交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率即引起50%抑制的葉酸標(biāo)準(zhǔn)物濃度(葉酸IC50)與引起50%抑制的葉酸類似物濃度(葉酸相似物IC50)值之比。本試驗(yàn)分別測(cè)定了該試劑盒與四氫葉酸、二氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、VB12、亞葉酸等的交叉反應(yīng)率。按照公式(2)計(jì)算交叉反應(yīng)率。
4)樣本測(cè)值相關(guān)性:對(duì)照方法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中微生物法[8]。本方法與對(duì)照方法同步檢測(cè)50例樣本,分析測(cè)值相關(guān)性。
5)加標(biāo)回收率測(cè)定:取兩份相同的樣品,其中一份加入定量的待測(cè)成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用本方法同時(shí)測(cè)定兩份樣品結(jié)果,加標(biāo)樣品測(cè)值減去未加標(biāo)樣品測(cè)值所得差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。按照公式(3)計(jì)算加標(biāo)回收率。本研究共加入低、中、高3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。
6)樣品基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定
取一高值樣品(濃度約為80 ng/mL),用PBS梯度稀釋,分別稀釋為原來濃度的1/1,1/2,1/4,1/8,1/16,1/ 32,以理論濃度做x軸,以檢測(cè)濃度做y軸,進(jìn)行曲線擬合,分析曲線斜率與截距,以及檢測(cè)濃度與理論濃度的偏差,分析基質(zhì)效應(yīng)的影響大小。
1.2.9牛奶樣品中葉酸本底含量的測(cè)定
收集市售牛奶樣品80例,用本方法測(cè)定樣品中的葉酸,分析市售牛奶樣品中葉酸的本底范圍、平均值,含量分布規(guī)律等等。
1.2.10數(shù)據(jù)處理
采用Minitab16進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。
2.1抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定
棋盤法ELISA結(jié)果見表1。
表1 棋盤ELISA結(jié)果Table 1The results of checkerboard ELISA
由表1數(shù)據(jù)分析得出,當(dāng)包被濃度為2 μg/mL,葉酸-HRP稀釋度為1 μg/mL時(shí),其OD為2.025,最接近2.0,因此選擇此濃度作為最佳工作濃度。
2.2抗體包被條件的確定
不同包被條件下的陰、陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值與N/P比見表2。
表2 不同包被條件下的陰、陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值與N/P比Table 2OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different coating condition
由表2數(shù)據(jù)分析得出,碳酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH 9.6),4℃過夜包被具有最佳的N/P比(38.2),因此選擇此條件作為最佳抗體包被條件。
2.3封閉劑的確定
不同封閉劑條件下的陰、陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值與N/ P比見表3。
表3 不同封閉劑條件下的陰、陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值與N/P比Table 3OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different blocking condition
由表3數(shù)據(jù)分析得出,1%的明膠封閉具有最佳的N/P比(37.5),1%BSA封閉次之(35.7),5%奶粉封閉效果最差(19.4),考慮到前兩者差距不大,另外由于1%明膠的配制需要加熱,過程略微繁瑣,因此選擇1%的BSA作為封閉劑。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
本方法與對(duì)照方法(微生物法)的定標(biāo)曲線見圖1、圖2。
由圖1數(shù)據(jù)來看,本方法的定標(biāo)曲線為y=3.441-1.702 log10(x),線性回歸系數(shù)R2=0.998,擬合度良好,符合預(yù)期。由圖2數(shù)據(jù)來看,對(duì)照方法(微生物法)采用三階多項(xiàng)式進(jìn)行擬合,擬合回歸系數(shù)R2=0.998,擬合度良好,符合預(yù)期,定標(biāo)曲線為y=-0.318 6x3+0.164 7x2+ 0.987 8x+0.009 18。
2.5本研究性能測(cè)定
1)最低檢測(cè)限:0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm測(cè)定結(jié)果見表4。
圖1 本方法定標(biāo)曲線Fig.1The calibration curve of the ELISA method
圖2 對(duì)照方法定標(biāo)曲線擬合結(jié)果Fig.2The calibration curve of the microbiological method
表40 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值Table 4OD450nmof the standard with the concentration of 0 ng/mL
由表4數(shù)據(jù)計(jì)算x-3s=2.997-0.048 4×3=2.773,根據(jù)圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度=2.22 ng/mL,即為最低檢測(cè)限。
2)精密度測(cè)試:本方法的精密度測(cè)定結(jié)果見表5。
表5 精密度測(cè)定結(jié)果Table 5The results of precision measurement
由表5可以看出低值樣本CV為3.49%,高值樣本CV為1.46%,二者均小于5%,具有良好的精密度。
3)特異性測(cè)定:本方法的特異性測(cè)試結(jié)果見表6。
表6 特異性測(cè)定結(jié)果Table 6The results of specificity assays
由表6可以看出,本方法與四氫葉酸的交叉反應(yīng)率為0.033%,與二氫葉酸的交叉反應(yīng)率為0.036%,與5-甲酰四氫葉酸交叉反應(yīng)率為0.10%,與VB12的交叉反應(yīng)率為0.01%,4種葉酸類似物的交叉反應(yīng)率均小于等于0.10%,特異性良好。
4)樣本測(cè)值相關(guān)性:本方法與對(duì)照方法測(cè)值相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。
圖3 本方法與對(duì)照方法測(cè)值相關(guān)性分析Fig.3The correlation analysis between the ELISA method and the comparison method
由圖3看出,線性回歸方程為:對(duì)照方法=0.985 6×本方法+1.044,回歸系數(shù)r=0.960,本方法與對(duì)照方法二者測(cè)值存在顯著性相關(guān)(P<0.05)。
5)加標(biāo)回收率測(cè)定:本方法的回收率測(cè)定結(jié)果見表7。
表7 加標(biāo)回率收測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 7The results of recovery test(n=6)
由表7可以看出,本方法的加標(biāo)回收率在94.50%~108.00%之間,具有良好的回收率。
6)基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定:本方法的基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果見圖4。
圖4 基質(zhì)效應(yīng)測(cè)定結(jié)果Fig.4The results of matrix effects test
在基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)試中,樣品實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的最大偏差為9.90%,由圖4可以看出,擬合方程為:實(shí)測(cè)濃度=0.998 4×理論濃度-0.753 4,回歸系數(shù)R2= 0.998,線性良好。擬合曲線的斜率=0.994 8≈1,截距-0.753 4,由此說明樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響微乎其微。
2.6市售牛奶樣品葉酸本底測(cè)定
80例牛奶樣品葉酸含量測(cè)定結(jié)果見圖5。
圖5 80例牛奶樣品葉酸含量測(cè)定結(jié)果Fig.5The folate concentration of 80 milk samples
由圖5可以得出,80例市售牛奶樣本,葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL~68.72 ng/mL,均值37.93 ng/mL,中位數(shù)38.24 ng/mL。其中,在30 ng/mL~40 ng/mL的樣品具有最高的頻數(shù),葉酸濃度超過60 ng/mL的樣品數(shù)量極少(4例),無葉酸濃度低于10 ng/mL的樣品。
葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,生化特性相近的化合物統(tǒng)稱,是由喋啶、對(duì)氨基苯甲酸和1個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成的維生素。國(guó)家食品葉酸檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法是微生物法,該方法檢測(cè)限為0.1 ng/mL[9],具有比本研究更高的靈敏度,但是微生物法試驗(yàn)周期長(zhǎng),每周一次的菌種傳代保藏比較繁瑣,另外試驗(yàn)所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和酶解液成本高,更易受外界葉酸污染而影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。HPLC方法也是食品或藥品葉酸檢測(cè)的常用方法,其最低檢出限10 μg/mL[10],HPLC法在測(cè)定成分復(fù)雜的食品樣品中的化合物形式葉酸時(shí),結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究所采用的葉酸抗體為小鼠抗葉酸單克隆抗體,其能夠與游離葉酸、化合物形式的葉酸以及葉酸蛋白結(jié)合物結(jié)合,因此與HPLC方法相比,測(cè)值結(jié)果更加準(zhǔn)確;
本研究所建立的ELISA方法其創(chuàng)新之處在于:
1)原料抗體為葉酸高特異性抗體,交叉反應(yīng)率低;
2)牛奶樣本基質(zhì)效應(yīng)對(duì)濃度結(jié)果的測(cè)定影響微乎其微;
3)檢測(cè)時(shí)間顯著縮短;
4)操作更加簡(jiǎn)便易行,而且試驗(yàn)試劑、試驗(yàn)流程更加安全;
另外,本方法的線性范圍為2.5ng/mL~100ng/mL,而經(jīng)過測(cè)量得到的牛奶中的葉酸本底含量為12.55ng/mL~68.72 ng/mL之間,正好在本方法線性范圍之內(nèi),樣本檢測(cè)過程中,無需經(jīng)過稀釋或濃縮步驟,試驗(yàn)誤差大大降低。
本研究檢測(cè)的牛奶樣品本底葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL~68.72 ng/mL,均值37.93 ng/mL,這與劉志楠等[11]的研究結(jié)果具有一致性。
綜上所述:本研究建立的ELISA方法具有良好的檢測(cè)限、線性范圍、精密度、特異性、樣本測(cè)值相關(guān)性、回收率以及較低的基質(zhì)效應(yīng),能夠滿足牛奶樣品葉酸含量的檢測(cè),值得推廣。
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ELISA Method for the Detection of Folate in Milk
LI Zhen
(Food Engineering Department,Inner Mongolia Business&Trade Vocational College,Hohhot 010070,Inner Mongolia,China)
Explored the establish of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method for milk folic acid detection and determine the initial content.Used a competitive enzyme immunoassay,checkerboard method to determine the optimal coating conditions,confinement,HRP labeled-antigen concentration etc.,then evaluated the performance and detect the folic acid content of 80 milk samples.The results showed:①The optimal ELISA conditions:coated the folate antibody with the concentration of 2 μg/mL,at the conditions of carbonate bufferand and 4℃,then blocked with 1%BSA,the working concentration of FA-HRP was 1 μg/mL.②In this study,the detection limit was 2.22 ng/mL,the precision test CV<5%;the cross-reactivity with folic acid analogs was less than 0.1%;there was a significant correlation(r=0.960,P<0.05)with the control method in the values of sample measurement;this method had a good recovery effect which was between 94.50%-108.00%;in this method,the sample matrix effects had no significant effect on the detection.③The concentration range of milk folic acid in the samples was12.55 ng/mL-68.72 ng/mL with an average of 37.93 ng/mL.This ELISA method could meet the testing of folic acid in milk.
enzyme-linkedimmunosorbentassay;folicacid;checkerboardmethod
10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.032
2015-11-17
內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)??茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZC13407)
李貞(1980—),男(蒙古),講師,碩士研究生,研究方向:食品加工與檢驗(yàn)方向。