李貞

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

ELISA方法檢測牛奶中葉酸含量

李貞

（內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古呼和浩特010070）

探討牛奶中葉酸檢測的酶聯(lián)免疫反應(yīng)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法建立及其葉酸本底含量測定。用競爭性酶聯(lián)免疫，棋盤法確定最佳抗體包被條件、封閉條件、酶標(biāo)抗原濃度等，并進(jìn)行性能評價測定，檢測80例牛奶樣品中的葉酸本底含量。結(jié)果表明：①最佳ELISA條件為：葉酸抗體以2 μg/mL濃度，碳酸鹽緩沖液4℃過夜包被，用1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，葉酸-辣根過氧化物酶標(biāo)記物（葉酸-HRP）工作濃度1 μg/mL。②該方法最低檢測限2.22 ng/mL；精密度測試CV＜5%；特異性檢測與葉酸類似物的交叉反應(yīng)率均≤0.1%；本方法與對照方法具有良好的樣本測值相關(guān)性（r=0.960，P＜0.05）；該方法加標(biāo)回收率在94.50%～108.00%之間，回收效果良好；樣品基質(zhì)效應(yīng)對該方法測值無顯著影響。③牛奶樣本葉酸本底含量范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL。本研究建立的ELISA方法能夠滿足牛奶樣品中葉酸含量的檢測。

酶聯(lián)免疫法；葉酸；棋盤法

葉酸是一種水溶性B族維生素，在人體中發(fā)揮重要的生理作用如：參與脫氧核糖核酸（DNA）與核糖核酸（RNA）的合成，防止DNA的變異，預(yù)防癌癥［1］；參與氨基酸的代謝，充當(dāng)甘氨酸與絲氨酸、組氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸與蛋氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程中的一碳載體［2］；參與血紅蛋白及甲基化合物如腎上腺素、膽堿、肌酸等的合成，是含鐵血紅蛋白的組分［3］。

葉酸對人體作用重大，但是人體自身不能合成葉酸，只能通過外界補(bǔ)充，因此食品中葉酸含量的高低直接影響著人體葉酸水平的高低。牛奶目前已經(jīng)成為民眾不可或缺的食品組成部分，因此其葉酸含量的檢測對于指導(dǎo)乳制品企業(yè)在合理范圍內(nèi)強(qiáng)化葉酸的添加量具有重大的意義。目前，牛奶中葉酸的檢測有很多方法［4］：如微生物法、化學(xué)發(fā)光測定法、離子捕獲法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、高效液相色譜法等，但都有其各自的缺陷，微生物法檢測周期長，菌種傳代保存比較繁瑣；化學(xué)發(fā)光法與熒光法對儀器要求較高；比色法和紫外分光光度法選擇性較差，容易被干擾；薄層層析法靈敏度較低，且只適合維生素制劑中葉酸的測定；高效液相色譜法靈敏度低，對儀器要求較高，樣本抗干擾能力差。

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）具有檢驗靈敏度高、特異性好、樣本處理量大、檢驗時間短、儀器要求低等諸多優(yōu)點，目前市場上幾乎沒有專門用于食品（牛奶）葉酸檢測的ELISA試劑盒，因此本研究旨在探討自主建立ELISA方法進(jìn)行牛奶中葉酸含量的檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑以及材料

酶標(biāo)板：Corning Incorporated（USA）；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich Co.LLC；葉酸單克隆抗體、葉酸-HRP：北京翰譜醫(yī)藥生物研究所；酶標(biāo)抗原稀釋液、TMB（四甲基聯(lián)苯胺）單組份顯色液：北京梅德厚普生物科技有限公司；清洗液（磷酸鹽緩沖液，20 mmol/L，pH 7.4）、終止液（0.5 mol/L硫酸）。

1.1.2主要儀器

洗板機(jī)：普朗集團(tuán)；酶標(biāo)儀：Thermo Multiskan。

1.2方法

1.2.1競爭ELISA程序［5］

1）包被抗體：將抗體用包被緩沖液稀釋到一定濃度，100 μL/孔，37℃或者4℃包被若干小時，洗板兩次。

2）封閉：每孔加入200 μL封閉液，37℃封閉2 h～4 h，洗板3次。

3）加樣：每孔加入樣品（標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品）50 μL以及稀釋的葉酸-HRP 50 μL，37℃反應(yīng)1 h，洗板5次。

4）顯色：每孔加入TMB單組份顯色底物100 μL，37℃反應(yīng)15 min。

5）終止讀數(shù)：每孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，記錄OD450nm。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備

電子天平準(zhǔn)確稱量50mg葉酸，倒入50mL容量瓶，用10mmol/LNaOH定容，搖勻溶解，此時濃度1mg/mL，移液器取上述液體1 mL放入1 L容量瓶，用生理鹽水稀釋至1 μg/mL，再繼續(xù)稀釋得到100、50、25、10、5、2.5 ng/mL以及0 ng/mL共7個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品置于棕色瓶中儲存。

1.2.3樣品的制備

5 mL的新鮮牛奶樣品（全脂乳或脫脂乳）置于試管中，2℃～8℃冷藏30 min。隨后樣品在3 000 r/min條件下離心10 min。上部的脂肪層吸出并棄去。剩余的水層以1∶5的體積比稀釋于樣品稀釋液中。

1.2.4抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定

采用棋盤法［6］，同時確定抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度，方法如下：抗體用pH=9.6的50 mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋，共4、2、1、0.5 μg/mL 4個梯度，4℃過夜包被，1%BSA封閉，然后每孔加入50 μL，濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入的1、0.5、0.2 μg/mL 3個梯度的葉酸-HRP，37℃反應(yīng)1 h，顯色，終止讀數(shù)。選取OD450nm最接近2.0的抗體包被濃度與葉酸-HRP稀釋濃度作為最佳工作濃度。

1.2.5抗體包被條件的確定

選擇3種包被液：檸檬酸緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0）、磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.4）、碳酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9.6）；兩種包被方式：37℃包被4 h、4℃過夜包被（12 h），按照1.2.4確定的最佳工作濃度試驗，比較各組陰陽性對照孔OD450nm值和N/P比，以確定最佳包被條件。

1.2.6封閉劑的確定

選擇3種封閉液：1%BSA、1%明膠、5%的奶粉，按照1.2.4確定的最佳工作濃度與1.2.5確定的最佳包被條件進(jìn)行試驗，比較各組陰陽性對照孔OD450nm值和N/P比，以確定最佳封閉條件。

1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

記標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x，記每個標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的OD450nm值為y，作x、y散點圖，采用合適的擬合方法進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，計算回歸方程以及回歸系數(shù)。

1.2.8本方法性能測定

1）最低檢測限：以0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為最低檢測限吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對應(yīng)的濃度即為最低檢測限濃度。

2）精密度測試：定標(biāo)后平行測試高值與低值樣本各10次，計算測定均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）。按照公式（1）計算變異系數(shù)。3）特異性測定［7］：特異性可用交叉反應(yīng)率來表示。交叉反應(yīng)率即引起50%抑制的葉酸標(biāo)準(zhǔn)物濃度（葉酸IC50）與引起50%抑制的葉酸類似物濃度（葉酸相似物IC50）值之比。本試驗分別測定了該試劑盒與四氫葉酸、二氫葉酸、5-甲酰四氫葉酸、VB12、亞葉酸等的交叉反應(yīng)率。按照公式（2）計算交叉反應(yīng)率。

4）樣本測值相關(guān)性：對照方法為國家標(biāo)準(zhǔn)方法中微生物法［8］。本方法與對照方法同步檢測50例樣本，分析測值相關(guān)性。

5）加標(biāo)回收率測定：取兩份相同的樣品，其中一份加入定量的待測成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用本方法同時測定兩份樣品結(jié)果，加標(biāo)樣品測值減去未加標(biāo)樣品測值所得差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論值之比即為樣品加標(biāo)回收率。按照公式（3）計算加標(biāo)回收率。本研究共加入低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。

6）樣品基質(zhì)效應(yīng)測定

取一高值樣品（濃度約為80 ng/mL），用PBS梯度稀釋，分別稀釋為原來濃度的1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/ 32，以理論濃度做x軸，以檢測濃度做y軸，進(jìn)行曲線擬合，分析曲線斜率與截距，以及檢測濃度與理論濃度的偏差，分析基質(zhì)效應(yīng)的影響大小。

1.2.9牛奶樣品中葉酸本底含量的測定

收集市售牛奶樣品80例，用本方法測定樣品中的葉酸，分析市售牛奶樣品中葉酸的本底范圍、平均值，含量分布規(guī)律等等。

1.2.10數(shù)據(jù)處理

采用Minitab16進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2結(jié)果與分析

2.1抗體最佳包被濃度及葉酸-HRP最佳工作濃度的確定

棋盤法ELISA結(jié)果見表1。

表1　棋盤ELISA結(jié)果Table 1The results of checkerboard ELISA

由表1數(shù)據(jù)分析得出，當(dāng)包被濃度為2 μg/mL，葉酸-HRP稀釋度為1 μg/mL時，其OD為2.025，最接近2.0，因此選擇此濃度作為最佳工作濃度。

2.2抗體包被條件的確定

不同包被條件下的陰、陽性對照OD450nm值與N/P比見表2。

表2　不同包被條件下的陰、陽性對照的OD450nm值與N/P比Table 2OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different coating condition

由表2數(shù)據(jù)分析得出，碳酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9.6），4℃過夜包被具有最佳的N/P比（38.2），因此選擇此條件作為最佳抗體包被條件。

2.3封閉劑的確定

不同封閉劑條件下的陰、陽性對照OD450nm值與N/ P比見表3。

表3　不同封閉劑條件下的陰、陽性對照的OD450nm值與N/P比Table 3OD450nmand N/P ratio of positive and negative controls in different blocking condition

由表3數(shù)據(jù)分析得出，1%的明膠封閉具有最佳的N/P比（37.5），1%BSA封閉次之（35.7），5%奶粉封閉效果最差（19.4），考慮到前兩者差距不大，另外由于1%明膠的配制需要加熱，過程略微繁瑣，因此選擇1%的BSA作為封閉劑。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

本方法與對照方法（微生物法）的定標(biāo)曲線見圖1、圖2。

由圖1數(shù)據(jù)來看，本方法的定標(biāo)曲線為y=3.441-1.702 log10（x），線性回歸系數(shù)R2=0.998，擬合度良好，符合預(yù)期。由圖2數(shù)據(jù)來看，對照方法（微生物法）采用三階多項式進(jìn)行擬合，擬合回歸系數(shù)R2=0.998，擬合度良好，符合預(yù)期，定標(biāo)曲線為y=-0.318 6x3+0.164 7x2+ 0.987 8x+0.009 18。

2.5本研究性能測定

1）最低檢測限：0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm測定結(jié)果見表4。

圖1　本方法定標(biāo)曲線Fig.1The calibration curve of the ELISA method

圖2　對照方法定標(biāo)曲線擬合結(jié)果Fig.2The calibration curve of the microbiological method

表40　ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品OD450nm值Table 4OD450nmof the standard with the concentration of 0 ng/mL

由表4數(shù)據(jù)計算x-3s=2.997-0.048 4×3=2.773，根據(jù)圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出對應(yīng)的濃度=2.22 ng/mL，即為最低檢測限。

2）精密度測試：本方法的精密度測定結(jié)果見表5。

表5　精密度測定結(jié)果Table 5The results of precision measurement

由表5可以看出低值樣本CV為3.49%，高值樣本CV為1.46%，二者均小于5%，具有良好的精密度。

3）特異性測定：本方法的特異性測試結(jié)果見表6。

表6　特異性測定結(jié)果Table 6The results of specificity assays

由表6可以看出，本方法與四氫葉酸的交叉反應(yīng)率為0.033%，與二氫葉酸的交叉反應(yīng)率為0.036%，與5-甲酰四氫葉酸交叉反應(yīng)率為0.10%，與VB12的交叉反應(yīng)率為0.01%，4種葉酸類似物的交叉反應(yīng)率均小于等于0.10%，特異性良好。

4）樣本測值相關(guān)性：本方法與對照方法測值相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。

圖3　本方法與對照方法測值相關(guān)性分析Fig.3The correlation analysis between the ELISA method and the comparison method

由圖3看出，線性回歸方程為：對照方法=0.985 6×本方法+1.044，回歸系數(shù)r=0.960，本方法與對照方法二者測值存在顯著性相關(guān)（P＜0.05）。

5）加標(biāo)回收率測定：本方法的回收率測定結(jié)果見表7。

表7　加標(biāo)回率收測定結(jié)果（n=6）Table 7The results of recovery test（n=6）

由表7可以看出，本方法的加標(biāo)回收率在94.50%～108.00%之間，具有良好的回收率。

6）基質(zhì)效應(yīng)測定：本方法的基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果見圖4。

圖4　基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果Fig.4The results of matrix effects test

在基質(zhì)效應(yīng)的測試中，樣品實測濃度與理論濃度的最大偏差為9.90%，由圖4可以看出，擬合方程為：實測濃度=0.998 4×理論濃度-0.753 4，回歸系數(shù)R2= 0.998，線性良好。擬合曲線的斜率=0.994 8≈1，截距-0.753 4，由此說明樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響微乎其微。

2.6市售牛奶樣品葉酸本底測定

80例牛奶樣品葉酸含量測定結(jié)果見圖5。

圖5　80例牛奶樣品葉酸含量測定結(jié)果Fig.5The folate concentration of 80 milk samples

由圖5可以得出，80例市售牛奶樣本，葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL，中位數(shù)38.24 ng/mL。其中，在30 ng/mL～40 ng/mL的樣品具有最高的頻數(shù)，葉酸濃度超過60 ng/mL的樣品數(shù)量極少（4例），無葉酸濃度低于10 ng/mL的樣品。

3討論

葉酸是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對氨基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結(jié)合而成的維生素。國家食品葉酸檢驗的標(biāo)準(zhǔn)方法是微生物法，該方法檢測限為0.1 ng/mL［9］，具有比本研究更高的靈敏度，但是微生物法試驗周期長，每周一次的菌種傳代保藏比較繁瑣，另外試驗所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和酶解液成本高，更易受外界葉酸污染而影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。HPLC方法也是食品或藥品葉酸檢測的常用方法，其最低檢出限10 μg/mL［10］，HPLC法在測定成分復(fù)雜的食品樣品中的化合物形式葉酸時，結(jié)果不準(zhǔn)確。本研究所采用的葉酸抗體為小鼠抗葉酸單克隆抗體，其能夠與游離葉酸、化合物形式的葉酸以及葉酸蛋白結(jié)合物結(jié)合，因此與HPLC方法相比，測值結(jié)果更加準(zhǔn)確；

本研究所建立的ELISA方法其創(chuàng)新之處在于：

1）原料抗體為葉酸高特異性抗體，交叉反應(yīng)率低；

2）牛奶樣本基質(zhì)效應(yīng)對濃度結(jié)果的測定影響微乎其微；

3）檢測時間顯著縮短；

4）操作更加簡便易行，而且試驗試劑、試驗流程更加安全；

另外，本方法的線性范圍為2.5ng/mL～100ng/mL，而經(jīng)過測量得到的牛奶中的葉酸本底含量為12.55ng/mL～68.72 ng/mL之間，正好在本方法線性范圍之內(nèi)，樣本檢測過程中，無需經(jīng)過稀釋或濃縮步驟，試驗誤差大大降低。

本研究檢測的牛奶樣品本底葉酸濃度范圍為12.55 ng/mL～68.72 ng/mL，均值37.93 ng/mL，這與劉志楠等［11］的研究結(jié)果具有一致性。

綜上所述：本研究建立的ELISA方法具有良好的檢測限、線性范圍、精密度、特異性、樣本測值相關(guān)性、回收率以及較低的基質(zhì)效應(yīng)，能夠滿足牛奶樣品葉酸含量的檢測，值得推廣。

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ELISA Method for the Detection of Folate in Milk

LI Zhen
（Food Engineering Department，Inner Mongolia Business&Trade Vocational College，Hohhot 010070，Inner Mongolia，China）

Explored the establish of enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）method for milk folic acid detection and determine the initial content.Used a competitive enzyme immunoassay，checkerboard method to determine the optimal coating conditions，confinement，HRP labeled-antigen concentration etc.，then evaluated the performance and detect the folic acid content of 80 milk samples.The results showed：①The optimal ELISA conditions：coated the folate antibody with the concentration of 2 μg/mL，at the conditions of carbonate bufferand and 4℃，then blocked with 1%BSA，the working concentration of FA-HRP was 1 μg/mL.②In this study，the detection limit was 2.22 ng/mL，the precision test CV＜5%；the cross-reactivity with folic acid analogs was less than 0.1%；there was a significant correlation（r=0.960，P＜0.05）with the control method in the values of sample measurement；this method had a good recovery effect which was between 94.50%-108.00%；in this method，the sample matrix effects had no significant effect on the detection.③The concentration range of milk folic acid in the samples was12.55 ng/mL-68.72 ng/mL with an average of 37.93 ng/mL.This ELISA method could meet the testing of folic acid in milk.

enzyme-linkedimmunosorbentassay；folicacid；checkerboardmethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.032

2015-11-17

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（NJZC13407）

李貞（1980—），男（蒙古），講師，碩士研究生，研究方向：食品加工與檢驗方向。