劉雪梅　王建偉　趙珈藝　王鳳麗　梁　曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078)

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清腦滴丸對(duì)大鼠腦缺血再灌注后炎性因子動(dòng)態(tài)變化的影響

劉雪梅王建偉趙珈藝王鳳麗梁曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078)

目的：觀察清腦滴丸對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注腦梗死面積，皮層腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)改變，探討淸腦滴丸治療急性腦梗死的可能機(jī)制。方法：線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型(MCAO)，隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，模型缺血1.5 h分別再灌注6 h、24 h、48 h、72 h、7 d，清腦滴丸各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)治療組。TTC染色腦片計(jì)算梗死面積。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)皮層IL-1β、TNF-α和IL-10。結(jié)果：腦組織TTC染色顯示模型各組均出現(xiàn)明顯梗死灶，在再灌24～72 h梗死面積最大(P<0.01)，清腦滴丸治療組的梗死面積明顯縮減，再灌24～72 h梗死面積減小最為明顯(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，再灌注6 h時(shí)IL-1β、TNF-α、IL-10出現(xiàn)升高，再灌注48～72 h達(dá)高峰(P<0.01)，至再灌注7 d仍有明顯升高。與各模型組比較，清腦滴丸治療組明顯下調(diào)IL-1β和TNF-α(P<0.01)；且能明顯上調(diào)IL-10(P<0.05～0.01)。結(jié)論：清腦滴丸能夠顯著下調(diào)腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β，上調(diào)IL-10，縮小腦梗死面積，減輕腦損傷，提示清腦滴丸治療急性腦梗死機(jī)制可能與調(diào)節(jié)炎癥因子，促炎因子與抗炎因子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)。

急性腦缺血再灌注；清腦滴丸；TNF-α；IL-1β；IL-10

腦缺血再灌注損傷可繼發(fā)性引起炎性反應(yīng)，產(chǎn)生的一系列炎性細(xì)胞因子在腦缺血中發(fā)揮著雙重作用。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是公認(rèn)的炎性介質(zhì)，可以促進(jìn)腦缺血損傷區(qū)黏附分子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤[1]。白細(xì)胞介素-10(IL-10)作為抑炎細(xì)胞因子，可通過抑制炎性因子合成，受體表達(dá)等途徑起到保護(hù)腦組織的作用[2]。炎性反應(yīng)的作用與急性腦缺血再灌注算上時(shí)間與程度密切相關(guān)。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)清腦滴丸能夠使腦缺血再灌注大鼠的行為學(xué)神經(jīng)功能評(píng)分升高，腦組織病理損傷減輕。本研究動(dòng)態(tài)觀察急性腦缺血再灌注不同時(shí)間引發(fā)不同程度腦損傷，檢測(cè)皮層TNF-α、IL-1β與IL-10，探討清腦滴丸治療急性腦梗死的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠168只，體重(220±20)g，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2004-0003；清腦滴丸，由北京同仁堂藥業(yè)提供。IL-1β、IL-10、TNF-α ELISA試劑盒購自上海聯(lián)碩公司生物科技有限公司。

1.2分組與給藥方法健康雄性SD大鼠，每組14只。分為：1)正常對(duì)照組：正常大鼠不手術(shù)。2)假手術(shù)組：大鼠麻醉后暴露頸總動(dòng)脈，栓線從左側(cè)頸總動(dòng)脈僅插入10 mm，未阻斷大腦中動(dòng)脈；灌胃等體積生理鹽水。3)模型組：分為腦缺血1.5 h后再灌6 h模型組(Ischemia 1.5 h/Reperfusion 6 h，R6 h)、再灌24 h模型組(R24 h)、再灌48 h模型組(R48 h)、再灌72 h模型組(R72 h)，再灌7 d模型組(R7 d)。大鼠給予線栓法阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈1.5 h后拔出栓線，0.5 h后灌胃生理鹽水一次，以后每隔12 h灌胃1次，模型組各組分別在拔出栓線6 h、24 h、48 h、72 h、7 d后處死。4)清腦滴丸組：分為清腦滴丸(Q)6 h組、Q24 h組、Q48 h組、Q72 h組、Q7 d組。造模方法同模型組，術(shù)后0.5 h予灌胃清腦滴丸配制溶液(90 mg/kg)1次，以后每隔12 h給藥1次，各組分別在拔出栓線6 h、24 h、48 h、72 h、7 d后處死，與模型組在時(shí)間點(diǎn)上一一對(duì)應(yīng)。

1.3腦缺血再灌注模型(MCAO)的建立參照Zea Longa[3]的方法加以改良，SD大鼠采用10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開，逐層分離組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(Common Carotid Artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(External Carotid Artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal Carotid Artery，ICA)，永久結(jié)扎CCA近心端、ECA根部，微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA的遠(yuǎn)心端，在CCA結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入頂端光滑成球面的直徑0.24 mm的尼龍線，經(jīng)CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動(dòng)脈(Anterior Cerebral Artery，ACA)的起始部，從而閉塞了大腦中動(dòng)脈(Middle Cerebral Artery，MCA)的起始部，造成了MCA供血相關(guān)區(qū)的梗死。尼龍線平均插入深度為(18.5±0.5)mm，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合皮膚，尼龍線末端暴露在體外。栓塞3 h、6 h、24 h、48 h、72 h后，拔出尼龍線，模擬急性腦缺血。假手術(shù)組除插線10 mm外，其余步驟同模型組。采用Zea Longa神經(jīng)癥狀評(píng)分，選1～3分的大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

表1　Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后，取7只大鼠新鮮腦組織去除嗅球，小腦和低位腦干，冠狀面均勻切5片，將切片放入1%TTC染液中，37℃水浴30 min，梗死部位呈白色，正常腦組織呈紅色。將切片依次擺好，拍照，采用Image-pro Plus 5.0軟件計(jì)算梗死面積。

1.4.2酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-1β、IL-10、TNF-α濃度：每組取7只新鮮缺血側(cè)大腦皮層，按重量體積比加冰冷生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，ELISA試劑盒檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1腦缺血面積檢測(cè)TTC染色，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色。正常組和假手術(shù)組：大腦紅染，未發(fā)現(xiàn)任何白色梗死區(qū)域；再灌6～7 d模型各組均出現(xiàn)不同面積的白色梗死灶，再灌24～72 h梗死面積最大(P<0.01)，給予清腦滴丸治療后，各組白色梗死灶面積減小，再灌24～72 h梗死面積減小最為明顯(P<0.01)。結(jié)果見表2，圖1。

2.2IL-1β、TNF-α、IL-10濃度假手術(shù)組與正常對(duì)照組大鼠相比較，IL-1β、TNF-α、IL-10無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組再灌注6 h出現(xiàn)IL-1β升高，再灌注48 h達(dá)高峰(P<0.01)，至再灌注7 d仍有處于高值，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)，清腦滴丸治療后，IL-1β在再灌注24 h開始出現(xiàn)降低，再灌注48～72 h降低最明顯(P<0.01)，在再灌注7 d仍有下降趨勢(shì)(P<0.01)。再灌注6 h時(shí)TNF-α出現(xiàn)明顯升高，再灌注48 h達(dá)到高峰，至7 d仍處于明顯升高狀態(tài)，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P<0.01)；與模型組比較，在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)，清腦滴丸治療后，TNF-α在再灌注6 h～7 d均有明顯降低(P<0.01)。再灌注6 h時(shí)IL-10出現(xiàn)升高，再灌注24～72 h升高達(dá)到頂峰，至再灌注7 d仍明顯高于假手術(shù)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)，清腦滴丸治療后，IL-10升高明顯(P<0.05～0.01)，再灌注7 d無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

圖1　TTC染色

組別(Group)腦梗死面積(%)Control0Sham0R6h20.60±4.34**R24h31.43±2.78**R48h26.98±2.09**R72h29.84±3.84**R7d16.37±4.55**Q6h17.49±6.31△Q24h18.98±3.40△△Q48h17.56±2.54△△Q72h15.87±5.53△△Q7d12.32±3.48△

注：*P<0.05，**P<0.01與相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較；△P<0.05，△△P<0.01與相同時(shí)間點(diǎn)模型組比較。

表3　IL-1β、TNF-α、IL-10變化

注：*P<0.05，**P<0.01與相同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較；△P<0.05，△△P<0.01與相同時(shí)間點(diǎn)模型組比較。

3　討論

正常情況下TNF、IL-1、IL-10等炎性因子的表達(dá)水平非常低，當(dāng)發(fā)生急性腦缺血后，諸多炎性細(xì)胞因子的大量表達(dá)，可加重?fù)p傷腦組織。當(dāng)發(fā)生急性腦缺血再灌注損傷，首先誘導(dǎo)前炎癥因子IL-1β、TNF-α大量產(chǎn)生，繼而刺激抗炎因子IL-10產(chǎn)生，促炎因子與抗炎因子之間的平衡失調(diào)，促進(jìn)了炎性反應(yīng)過程的發(fā)生發(fā)展。腦缺血再灌注后，細(xì)胞受到損傷，各種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和血管周圍的炎性細(xì)胞被激活，分泌大量的IL-1β，過多的、持續(xù)表達(dá)的IL-1β可以誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞在血管上黏附，釋放有害的炎性介質(zhì)，引起腦組織的損傷；同時(shí)IL-1β還可以激活內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦缺血程度加重[4-5]。TNF-α是由多種細(xì)胞分泌的一類多向性細(xì)胞因子。腦缺血后，TNF-α有加重局部腦損傷的作用，其機(jī)制可能為：增加毛細(xì)血管通透性和開放血腦屏障；損傷神經(jīng)髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞；促進(jìn)更多促炎細(xì)胞因子釋放，加重腦缺血后炎性反應(yīng)等[6]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可以抑制IL-1β和TNF-α產(chǎn)生，也可抑制細(xì)胞因子受體表達(dá)和激活。IL-10可通過抑制誘導(dǎo)型NO合成酶產(chǎn)生，減輕遲發(fā)性腦損傷，減少缺血后期NO生成，也可減少自由基產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用[2]。急性腦卒中患者初期IL-10即可升高，且IL-10水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷后IL-10變化晚于TNF-α、IL-1β等，且隨著IL-10的升高，TNF-α、IL-1β明顯降低[7]，證實(shí)急性腦缺血再灌注損傷后促炎和抗炎是一個(gè)相互作用的過程，抗炎和促炎作用處于動(dòng)態(tài)的非平衡狀態(tài)，導(dǎo)致?lián)p傷加重。

急性腦缺血屬中醫(yī)“中風(fēng)病”范疇。自內(nèi)經(jīng)對(duì)中風(fēng)病就有所描述，在“外風(fēng)”“內(nèi)風(fēng)”立論的基礎(chǔ)上，逐漸形成了基于風(fēng)、火、痰、瘀、虛等主因的辨證體系，其中“火、瘀”作為主要的致病因素，已被歷代醫(yī)家所認(rèn)可。王永炎院士提出“毒損腦絡(luò)”學(xué)說，認(rèn)為臟腑功能和氣血運(yùn)行失常，使體內(nèi)的病理或生理產(chǎn)物蘊(yùn)積過多，以致邪氣亢盛敗壞形體而轉(zhuǎn)化為毒,強(qiáng)調(diào)瘀毒、痰毒、熱毒互結(jié),損傷腦絡(luò)的理論觀點(diǎn)[8]。清腦滴丸來源于王永炎院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由三七、梔子、冰片組成，梔子味苦，性寒，瀉火解毒，主要針對(duì)由火致毒，是解火毒的主要藥物，三七味甘辛，氣微寒，長于活血化瘀之功效，冰片味苦，性微寒，香竄善走，清熱瀉火，醒腦開竅。三藥合用共奏清熱解毒，活血宣竅之功效。本團(tuán)隊(duì)前期臨床工作采用清腦滴丸用于治療腔隙性腦梗死之風(fēng)火上擾兼瘀血證患者，發(fā)現(xiàn)其明顯改善患者的神經(jīng)功能缺損程度，尤其治療“善忘遲鈍、頭痛、眩暈、口苦咽干、大便秘結(jié)、舌苔黃”等火熱、血瘀的癥狀效果顯著。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)清腦滴丸可明顯減輕急性局灶性腦缺血大鼠腦組織病理損害，減輕酸中毒、抑制自由基損傷、恢復(fù)自由基代謝平衡，抑制黏附分子表達(dá)，調(diào)節(jié)炎性因子保護(hù)受損的腦組織[9-10]。從藥代動(dòng)力學(xué)角度也發(fā)現(xiàn)急性腦缺血模型對(duì)清腦滴丸有效組分的生物利用度最高[11]。本研究證實(shí)清腦滴丸能夠顯著下調(diào)腦缺血再灌注后TNF-α、IL-1β，上調(diào)IL-10，縮小腦梗死面積，減輕腦損傷，提示清腦滴丸治療急性腦梗死可能與調(diào)節(jié)炎性因子，促炎因子與抗炎因子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，為該藥臨床治療提供了科研依據(jù)。

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(2015-12-28收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effects of Qingnao Dripping Pills on Dynamic Changes of Inflammatory Factors after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

Liu Xuemei, Wang Jianwei, Zhao Jiayi, Wang Fengli, Liang Xiao

(Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China)

Objective:To observe the cerebral infarct area and contents of tumor Necrosis Factor-α(TNF-α), interleukin-1β(IL-1β) and interleukin-10(IL-10) in rats with acute cerebral infarction, and discuss the mechanism of Qingnao dripping pills in treating such diseases. Methods:The rat models of focal cerebral ischemia and reperfusion were made by thread occlusion technique induced middle cerebral artery occlusion. Rats were randomly divided into 12 groups: control group, sham group, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h reperfusion respectively after 1.5 h ischemia by MCAO, and Qingnao dripping pills groups. Using TTC staining brain to measure infarction area, ELISA to measure IL-1β, TNF-α and IL-10. Results:TTC staining display model group had obvious infarcts, and the infarction area was the largest during 24 h to 72 h reperfusion(P<0.01); while after giving Qingnao dripping pills, the infarction area was significantly reduced(P<0.01). Compared with sham group, IL-1β, TNF-α and IL-10 appeared to rise at 6 h, and at 48 h and 72 h reached reperfusion peak (P<0.01). There was an increasing rise at 7d reperfusion. Compared with the model groups, IL-1β and TNF-α in the Qingnao dripping pills treatment group significantly decreased(P<0.01) and IL-10 obviously increased(P<0.05 ～ 0.01). Conclusion:Qingnao dripping pills can significantly decrease TNF-a and IL-1β and increase IL-10; thus reducing cerebral infarction area and improve brain damage. This may due to that it can modulate inflammatory factor, pro-inflammatory factor and anti-inflammatory factor to achieve dynamic balance.

Acute cerebral ischemia-Reperfusion; Qingnao dripping pills; TNF-α;IL-1β; IL-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)：81202683)；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào):2011-CXTD-23)

劉雪梅(1979.1—)，女，博士，副研究員，研究方向：中醫(yī)藥防治中風(fēng)病機(jī)制研究，E-mail:liuxuemei04@126.com

R544+.9

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.007