方金龍，王元，李新蒼，周俊芳，陳甜甜，房文紅*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上?！?00090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上?！?01306）

亞硝基氮脅迫下WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦致病性研究

方金龍1,2，王元1，李新蒼1，周俊芳1，陳甜甜1,2，房文紅1*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海201306）

為評(píng)價(jià)養(yǎng)殖水環(huán)境中亞硝基氮（NO2--N）對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）危害性，開(kāi)展NO2--N脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦感染白斑綜合征病毒（WSSV）后的死亡率、WSSV在患病對(duì)蝦體內(nèi)增殖速率和對(duì)蝦主要免疫相關(guān)酶活性影響研究。試驗(yàn)設(shè)置NO2--N脅迫濃度為6.68 mg·L-1，分別注射10-4和10-5稀釋度的WSSV提取液，結(jié)果顯示，脅迫下感染10-4WSSV的凡納濱對(duì)蝦144 h死亡率達(dá)90.00%，顯著高于無(wú)脅迫組（60.00%），相同試驗(yàn)條件下高濃度病毒感染組死亡率高于低濃度組。對(duì)蝦鰓組織WSSV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，NO2--N脅迫下凡納濱對(duì)蝦鰓組織內(nèi)WSSV增殖加快，感染48 h后10-4攻毒濃度脅迫組病毒量是無(wú)脅迫組1.33倍，72 h時(shí)病毒量達(dá)到無(wú)脅迫組2.00倍。此外，免疫相關(guān)酶活性結(jié)果顯示，NO2--N濃度突變導(dǎo)致對(duì)蝦血清中酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性先升后降。由此可見(jiàn)，NO2--N脅迫會(huì)加快WSSV在患病凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)增殖，導(dǎo)致高死亡率，這可能是脅迫造成對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性降低和抗病原感染能力下降所致。

凡納濱對(duì)蝦；WSSV；脅迫；亞硝基氮；致病性

方金龍，王元，李新蒼，等.亞硝基氮脅迫下WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦致病性研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（9）：39-45.

Fang Jinlong，Wang Yuan，Li Xincang，et al.Study on the pathogenicity of WSSV to the cultured shrimpLitopenaeus vannameiunder nitrite stress［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2016，47（9）：39-45.（in Chinese with English abstract）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，因其含肉率高、生長(zhǎng)快、抗逆力強(qiáng)、繁殖期長(zhǎng)、耐低鹽度、高密度養(yǎng)殖、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，成為世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的三大品種之一［1］。隨著養(yǎng)殖范圍擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度提高，病害爆發(fā)成為制約因素。何建國(guó)等研究表明，白斑綜合征（WSS）是對(duì)蝦常見(jiàn)病，7 d內(nèi)死亡率達(dá)100%［2］。研究表明，白斑癥爆發(fā)和溫度、鹽度、pH、氨氮含量、NO2--N含量等養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境變化有關(guān)，NO2--N是重要水質(zhì)指標(biāo)之一，NO2--N偏高，使對(duì)蝦慢性中毒，抗病力降低［3-5］。本試驗(yàn)探討NO2--N脅迫對(duì)感染W(wǎng)SSV凡納濱對(duì)蝦的發(fā)病死亡和病毒增殖情況，脅迫環(huán)境下對(duì)蝦體液免疫相關(guān)因子活性變化，揭示養(yǎng)殖環(huán)境與對(duì)蝦健康和病毒增殖關(guān)系，為對(duì)蝦病害防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

凡納濱對(duì)蝦為東海水產(chǎn)研究所福鼎研究中心土池養(yǎng)殖，亞硝基氮脅迫感染W(wǎng)SSV試驗(yàn)用蝦體質(zhì)量為（7.5±0.5）g，脅迫環(huán)境對(duì)免疫相關(guān)酶活性影響試驗(yàn)用蝦體質(zhì)量為（10.0±1.0）g。對(duì)蝦從土塘捕撈后于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。試驗(yàn)海水鹽度為24，水溫為（25±1）℃，pH 7.9～8.1，24 h曝氣。每天換1/2水，正常投喂商品顆粒飼料。

1.2試劑與儀器

分析純NaNO2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；左旋多巴購(gòu)自SIGMA-ALDRICH公司；SYBR Premix Ex TaqTM等購(gòu)自TaKaRa公司；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；0.22 μm濾膜購(gòu)自蘇州賽恩斯儀器有限公司；超微量微孔板分光光度計(jì)（Epoch）購(gòu)自BioTek公司；便攜式水質(zhì)檢測(cè)儀（Octadem）購(gòu)自無(wú)錫奧克丹生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOne Plus）購(gòu)自ABI公司。

1.3WSSV粗提液制備

參照周俊芳等［6］方法，取感染W(wǎng)SSV死亡的凡納濱對(duì)蝦，去甲殼，剪取腹部肌肉，按質(zhì)量體積比1∶9加入預(yù)冷PBS（pH 7.4），玻璃勻漿器冰浴環(huán)境中充分勻漿，將勻漿液先經(jīng)8層紗布過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液作為WSSV粗提液，混勻后分裝到離心管中-40℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4NO2--N脅迫下WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦致死率影響

參照文獻(xiàn)［7］作預(yù)試驗(yàn)，確定NO2--N脅迫濃度7 mg·L-1，實(shí)際檢測(cè)結(jié)果為6.68 mg·L-1；經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，確定對(duì)蝦攻毒W(wǎng)SSV粗提液稀釋度為10-4和10-5。

試驗(yàn)設(shè)6組，分別為無(wú)脅迫下注射PBS（無(wú)脅迫PBS組）、注射10-5稀釋度WSSV（無(wú)脅迫10-5組）、注射10-4稀釋度WSSV（無(wú)脅迫10-4組），和NO2--N脅迫下注射PBS（脅迫PBS組）、注射10-5稀釋度WSSV（脅迫10-5組）、注射10-4稀釋度WSSV組（脅迫10-4組），用1 mL注射器在每尾蝦第一腹節(jié)注射25 μL稀釋后WSSV粗提液，設(shè)置2個(gè)平行，每個(gè)平行30尾蝦，養(yǎng)于裝有200 L海水玻璃鋼桶中。試驗(yàn)過(guò)程中，每天檢測(cè)試驗(yàn)水質(zhì)中NO2--N濃度，觀察對(duì)蝦死亡情況并記錄。

1.5NO2--N脅迫下WSSV在凡納濱對(duì)蝦鰓組織內(nèi)增殖速率

試驗(yàn)分為4組，分別為無(wú)脅迫下10-4、10-5稀釋度WSSV攻毒組，和脅迫下10-4、10-5稀釋度WSSV攻毒組，設(shè)置2個(gè)平行，每個(gè)平行30尾蝦，NO2--N脅迫濃度為6.68 mg·L-1。試驗(yàn)攻毒方法同1.4。在注射WSSV后48、72、96、120和144 h，每組每個(gè)平行各采3尾蝦，于-40℃冰箱中冷凍保存，用于WSSV定量檢測(cè)。

取上述凍存對(duì)蝦的鰓組織作為樣品，采用TIANGEN公司海洋動(dòng)物組織總DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，以引物VP28F/VP28R采用普通PCR法檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)蝦是否感染W(wǎng)SSV［10］，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

模板稀釋50倍后用VP28F/VP28R和β-actineF/ β-actineR兩對(duì)引物熒光定量PCR，檢測(cè)引物參照表1，體系設(shè)定為20 μL，反應(yīng)程序參照SYBR Pre?mix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)。

表1　熒光定量PCR檢測(cè)WSSV Vp28基因和β-actin基因所用引物Table 1Primers used for quantitative real-time PCR of WSSV Vp28 and β-actin

1.6NO2--N脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清免疫酶活性影響

NO2--N脅迫對(duì)免疫酶活性影響試驗(yàn)分為濃度突變和逐漸升高2種方法。濃度突變脅迫試驗(yàn)是將對(duì)蝦從正常養(yǎng)殖海水（NO2--N是0.04 mg·L-1）直接投到NO2--N濃度為6.68 mg·L-1海水中；濃度逐漸升高脅迫試驗(yàn)為每6 h氨氮濃度升高0.33 mg·L-1，至6.68 mg·L-1維持不變。每組120尾對(duì)蝦，養(yǎng)殖在800 L玻璃鋼桶內(nèi)，每天換水1半，事先將換水調(diào)至相應(yīng)濃度。水中NO2--N用高濃度NaNO2溶液調(diào)配。試驗(yàn)過(guò)程中除采樣外，對(duì)蝦成活率為100%。試驗(yàn)開(kāi)始后，每組在0、6、12、24、48、96、144 h各隨機(jī)采集15尾蝦，每3尾為1組，從對(duì)蝦的腹部血竇處抽取血淋巴，于2 mL離心管中-40℃冷凍保存。取出冷凍保存的對(duì)蝦血淋巴，于4℃冰箱中解凍后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清，檢測(cè)免疫相關(guān)酶的活性［12］。

PO活性檢測(cè)方法參照Sun等［13］，以左旋多巴為底物，采用96孔板法。向96孔板中加入200 μL磷酸緩沖液（pH 6.0，0.01 mol·L-1），再加入10 μL血淋巴上清液和10 μL左旋多巴（0.01 mol·L-1），立即混勻，于酶標(biāo)儀中490 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值變化，每2 min檢測(cè)1次，共檢測(cè)15次。以時(shí)間和OD值變化作曲線，求曲線變化率，以試驗(yàn)條件下，每分鐘OD490增加0.001為1個(gè)酶活單位。

AKP、ACP活性使用南京建成生物工程研究所酶活檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

不同處理組之間和同組不同時(shí)間點(diǎn)之間對(duì)蝦死亡率、病毒增殖量、PO、ACP、AKP活性等差異顯著性采用SPSS 22單因素方差分析處理；WSSV熒光定量數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

2　結(jié)果與分析

2.1NO2--N脅迫下WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦致死率

注射稀釋W(xué)SSV粗提液組，對(duì)蝦在攻毒36 h后即表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍，食欲減退，身體透明度降低，體色發(fā)紅，身體失去平衡，在水面或貼著桶壁側(cè)游，發(fā)病死亡的對(duì)蝦甲殼易剝離，72 h后頭胸甲殼上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)。注射相同稀釋度病毒粗提液的對(duì)蝦，脅迫組比無(wú)脅迫組癥狀更加明顯。脅迫和無(wú)脅迫水質(zhì)環(huán)境下，10-5和10-4兩個(gè)WSSV稀釋度攻毒組對(duì)蝦死亡率情況見(jiàn)圖1，攻毒48 h后各試驗(yàn)組對(duì)蝦死亡率逐漸升高，144 h死亡率分別達(dá)90.00%（NO2--N脅迫WSSV10-4），60.00%（無(wú)脅迫WSSV10-4），56.67%（NO2--N脅迫WSSV10-5），40.00%（無(wú)脅迫WSSV10-5），脅迫環(huán)境和無(wú)脅迫環(huán)境下相比，死亡率差異顯著（P＜0.05）。試驗(yàn)中注射PBS組對(duì)蝦死亡率在試驗(yàn)開(kāi)始后48 h分別達(dá)5%（無(wú)脅迫PBS）和1.67%（脅迫PBS），隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率不再增加，存活對(duì)蝦健康狀況良好。

圖1　亞硝基氮脅迫下WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦致死率Fig.1Effect of nitrite on mortalities of L.vannamei infected by WSSV

2.2NO2--N脅迫下WSSV在凡納濱對(duì)蝦鰓組織內(nèi)增殖速率

無(wú)脅迫WSSV10-5，無(wú)脅迫WSSV10-4，脅迫WSSV10-5，脅迫WSSV10-44個(gè)組對(duì)蝦鰓組織內(nèi)病毒增殖速率變化見(jiàn)圖2。對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV到48 h時(shí)，脅迫組病毒量高于相同攻毒濃度的無(wú)脅迫組，差異性不顯著（P＞0.05），隨攻毒時(shí)間延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組對(duì)蝦鰓組織內(nèi)病毒快速增殖，脅迫WSSV10-4組病毒增殖速率最快，72 h達(dá)到最高值，病毒量顯著高于其他3組（P＜0.05）。無(wú)脅迫WSSV10-5、脅迫WSSV10-5、無(wú)脅迫WSSV10-4組病毒增殖速率較慢，在96、120 h達(dá)最高。病毒量達(dá)到最高后，各試驗(yàn)組病毒增殖變化無(wú)規(guī)律，變化量差異不顯著（P＞0.05）。

2.3NO2--N脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清免疫酶活性影響2.3.1PO

NO2--N脅迫下試驗(yàn)組和對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦血清中PO活性變化見(jiàn)圖3。NO2--N濃度突變組在脅迫開(kāi)始后PO活性先升高，6 h采樣點(diǎn)時(shí)達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，活性開(kāi)始下降，脅迫48 h后，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），活性最高值是最低值的3.6倍。與對(duì)照組相比，NO2--N濃度逐漸增加組隨著脅迫濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，PO活性顯著性變化（P＞0.05）。

圖2　亞硝基氮脅迫下WSSV在凡納濱對(duì)蝦鰓組織內(nèi)增殖Fig.2Effect of nitrite on WSSV quantity of L.vannamei detected by quantitative real-time PCR

圖3　亞硝基氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清PO活性變化Fig.3Effect of nitrite on PO activity of L.vannamei

2.3.2ACP

NO2--N脅迫組和對(duì)照組中凡納濱對(duì)蝦的血清ACP酶活性變化見(jiàn)圖4。脅迫開(kāi)始后，NO2--N濃度突變組對(duì)蝦血清ACP活性增強(qiáng)，48 h時(shí)達(dá)到最高，顯著高于對(duì)照組和濃度逐漸增加組（P＜0.05），隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，活性降低。NO2--N濃度逐漸增加組，ACP活性隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.3AKP

對(duì)照組和NO2--N脅迫下試驗(yàn)組的凡納濱對(duì)蝦血清AKP活性變化見(jiàn)圖5。脅迫試驗(yàn)開(kāi)始后，NO2--N濃度突變組AKP活性顯著增強(qiáng)，在6 h時(shí)達(dá)最高，是對(duì)照組的2.04倍，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，活性降低，96 h時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。NO2--N濃度逐漸增加組，隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，AKP活性與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖4　亞硝基氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清ACP活性變化Fig.4Effect of nitrite on ACP activity of L.vannamei

圖5　亞硝基氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清AKP活性變化Fig.5Effect of stress of nitrite on AKP activity of L.vannamei

3　討論與結(jié)論

亞硝酸鹽是氧氣不足或溫度偏低時(shí)，不完全硝化反應(yīng)中間產(chǎn)物。亞硝基氮主要通過(guò)呼吸作用，由鰓絲進(jìn)入動(dòng)物血液循環(huán)，與血藍(lán)蛋白結(jié)合形成高鐵血藍(lán)蛋白對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生毒性。高鐵血藍(lán)蛋白不能載氧，導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞缺氧處于應(yīng)激狀態(tài)，甚至窒息死亡。養(yǎng)殖環(huán)境下，水體中亞硝酸鹽濃度高于0.1 mg·L-1，就會(huì)危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物。郭慧等［10］研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦在20 mg·L-1NO2--N脅迫下，48 h后血細(xì)胞活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）含量和對(duì)照組相比，極顯著增加，非特異性酯酶活性顯著性降低。Cheng等研究表明，隨著亞硝酸鹽濃度升高和暴露時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)蝦血淋巴pH、氧合血藍(lán)蛋白和血藍(lán)蛋白濃度降低，血淋巴氧合血藍(lán)蛋白轉(zhuǎn)為脫氧血藍(lán)蛋白，從而降低對(duì)氧的親和力，導(dǎo)致機(jī)體輸氧能力下降，使機(jī)體因缺氧產(chǎn)生損傷［11］。

WSSV是迄今為止對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的一種病毒，具有宿主泛嗜性［12］。根據(jù)Sun等研究，實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)到WSSV感染中國(guó)對(duì)蝦以后，其在對(duì)蝦體內(nèi)的增殖符合一步法增殖規(guī)律，即分為輕度感染階段、中度感染階段、和重度感染階段，相對(duì)應(yīng)現(xiàn)象是無(wú)死亡發(fā)生、少量死亡和大量死亡發(fā)生［13］。這與該試驗(yàn)中以凡納濱對(duì)蝦為試驗(yàn)對(duì)象的死亡現(xiàn)象和檢測(cè)的病毒增殖規(guī)律一致。徐美麗等用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)134尾不同發(fā)病程度的對(duì)蝦，初步判斷對(duì)蝦WSSV爆發(fā)的臨界值是每毫克組織攜帶103個(gè)病毒粒子，進(jìn)一步界定病毒增殖與發(fā)病關(guān)系［14］。該試驗(yàn)中，NO2--N脅迫下，病毒增殖量更快達(dá)到最高值，死亡率高于無(wú)脅迫環(huán)境，說(shuō)明養(yǎng)殖水體中NO2--N濃度升高降低對(duì)蝦健康水平，增強(qiáng)WSSV對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致病性。

PO是酚氧化酶原激活系統(tǒng)被病原激活時(shí)釋放的產(chǎn)物，是節(jié)肢動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。能與酚氧化酶原系統(tǒng)被激活后釋放的其他物質(zhì)共同介導(dǎo)黑化作用、細(xì)胞黏附、包囊形成、血細(xì)胞遷移和吞噬等反應(yīng)，最終消滅侵入異物［15］。對(duì)蝦血清酚氧化酶活性受環(huán)境因子影響很大，趙先銀等研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH變化后，凡納濱對(duì)蝦血清PO活性有較大幅度變化［16］。Vargas-Al?bores等研究發(fā)現(xiàn)加利福尼亞對(duì)蝦（Farfantepenaeus californeiensis）幼蝦血細(xì)胞中proPO隨鹽度（44～28）下降而減少，PO活力升高［17］。該試驗(yàn)中，凡納濱對(duì)蝦在6.68 mg·L-1NO2--N脅迫下，PO活性先升后降，最后顯著低于對(duì)照組，變化幅度顯著，表明高濃度NO2--N可以顯著影響凡納濱對(duì)蝦血清PO活性。濃度逐漸增加到6.68 mg·L-1組，對(duì)蝦血清PO活性無(wú)顯著性變化，說(shuō)明對(duì)蝦對(duì)緩慢增加的NO2--N脅迫有一定適應(yīng)能力。

ACP和AKP在甲殼動(dòng)物體內(nèi)是溶酶體重要組成部分，也是水解酶體系的一部分，參與血細(xì)胞的吞噬和包囊反應(yīng)，破壞和消除侵入體內(nèi)外援物質(zhì)［18-19］。李長(zhǎng)紅等在三疣梭子蟹血清中檢測(cè)到ACP和AKP活性［19］。管小娟等認(rèn)為ACP和AKP可以判斷甲殼動(dòng)物免疫能力［20］。呂曉燕等研究發(fā)現(xiàn)，紅螯光殼螯蝦在不同濃度NO2--N下脅迫20 d后，隨NO2--N脅迫濃度增加，肝胰腺和鰓組織中AKP和ACP活性逐漸降低［21］。該試驗(yàn)中水體NO2--N濃度突然增加時(shí)，對(duì)蝦血清AKP和ACP活性有所增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間脅迫，破壞對(duì)蝦免疫系統(tǒng)，免疫相關(guān)酶活性減弱。

綜合分析血清PO等酶活、WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)增殖、感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦死亡率變化與脅迫時(shí)間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三者有一定相關(guān)性。NO2--N突變環(huán)境下，48 h開(kāi)始，血清PO和AKP活性均弱于對(duì)照組，WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)快速增加，出現(xiàn)發(fā)病死亡，與對(duì)照組無(wú)顯著差異；隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，PO、ACP、AKP活性均在降低，脅迫環(huán)境下對(duì)蝦體內(nèi)WSSV量升高，對(duì)蝦死亡率快速增加。由此可見(jiàn)，高濃度NO2--N突變脅迫下，對(duì)蝦血清免疫酶活性下降，對(duì)病原抵抗力降低，導(dǎo)致WSSV快速增殖，對(duì)蝦發(fā)病死亡。

［1］王興強(qiáng)，馬甡，董雙林.凡納濱對(duì)蝦生物學(xué)及養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.海洋湖沼通報(bào)，2004（4）：94-100.

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Study on the pathogenicity of WSSV to the cultured shrimpLitopenaeus vannameiunder nitrite stress

FANG Jinlong1，2，WANG Yuan1，LI Xincang1，ZHOU Junfang1，CHEN Tiantian1，2，F(xiàn)ANG Wenhong
（1.Key and Open Laboratory of Marine and Estuarine Fisheries，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fisheries Science，Shanghai 200090，China；2.School of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order to evaluate the harmfulness of nitrite on white pacific shrimp，Litopenaeus vannamei，this study was conducted to determine the effects of nitrite（NO2--N）on mortality of shrimp infected with WSSV，WSSV proliferation in infected shrimp and activity of immune-related enzymes in serum.The experiment consisted of treatments infected with WSSV extract of 10-5and 10-4dilution under the stress of 6.68 mg·L-1NO2--N，and there were the relative groups without stress as control.The results showed that the mortality of the treatment of stress-10-4WSSV reached 90.00%at 144 h，significantly higher than control of stress-free-WSSV 10-4with 60.00%mortality.Treatment with higher concentration of WSSV infection hadhigher mortality than that with lower concentration of WSSV infection under the same condition.Meanwhile，the amount of WSSV determined by Real-time Relative PCR showed that the stress of NO2--N accelerated WSSV proliferation in shrimp gills.The WSSV quantity of 10-4stress group was 1.33 times that of stress-free group at 48 h while it reached 2.00 times at 72 h.In addition，immunity-related enzymes activity experiment showed that the activities of phenoloxidase（PO），acid phosphatase（ACP）and alkaline phosphatase（AKP）in shrimp serum elevated first and then declined with time prolonged under stress of NO2--N.This study indicated that synergy of NO2--N accelerated WSSV proliferation in WSSV-infected shrimp and caused higher mortality，because environment stress lowered the activities of immune-related enzymes and the ability of anti-infection of shrimp.

Litopenaeus vannamei；WSSV；stress；nitrite；pathogenicity

S945

A

1005-9369（2016）09-0039-07

2016-07-07

上海市蝦類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目（滬農(nóng)科產(chǎn)字（2014）第5號(hào)）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第6-4號(hào)）

方金龍（1989-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物疾病防治。E-mail：fangjlzt@163.com

房文紅，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物疾病與藥理學(xué)。E-mail：fwenhong@163.com