羅愛(ài)勤　陳　亮　李　菁

（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司/中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣州510240）

靈芝孢子多糖含量不同方法測(cè)定的比較※

羅愛(ài)勤陳亮李菁

（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司/中藥提取分離過(guò)程現(xiàn)代化國(guó)家工程研究中心，廣州510240）

目的比較3種不同方法測(cè)定靈芝孢子中多糖的含量。方法采用2015版《中國(guó)藥典》一部靈芝藥材項(xiàng)下收載的多糖含量測(cè)定方法，《保健食品功效成分檢測(cè)方法》（白鴻主編）中粗多糖的苯酚-硫酸分光光度測(cè)定法和葡聚糖的分光光度測(cè)定法測(cè)定靈芝孢子中多糖含量。結(jié)果10批靈芝孢子中，藥典蒽酮硫酸法測(cè)得的多糖百分含量均值為2.05%；苯酚-硫酸法測(cè)得的多糖百分含量均值為2.72%；葡聚糖分光光度法測(cè)得的多糖百分含量均值為1.09%。結(jié)論3種不同測(cè)定方法測(cè)定靈芝孢子的多糖含量存在較大的差異。

靈芝孢子；多糖；含量測(cè)定

靈芝是多孔菌科靈芝屬的一種藥用真菌，在我國(guó)具有悠長(zhǎng)的藥用歷史［1］，靈芝孢子是靈芝在生長(zhǎng)成熟期從菌蓋彈射出來(lái)的極其細(xì)小的卵狀生殖孢子，靈芝孢子含有豐富的多糖、三萜、脂肪酸以及多種氨基酸及微量元素，在調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖方面有明顯作用［2-6］。近年來(lái)，靈芝孢子相關(guān)保健食品等產(chǎn)品發(fā)展迅速，市場(chǎng)上含靈芝孢子的產(chǎn)品繁多，但是，各類(lèi)靈芝孢子產(chǎn)品的多糖含量卻參差不齊。目前，《中國(guó)藥典》（2015版）一部?jī)H收錄了靈芝標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定靈芝的多糖含量測(cè)定法［7］，但靈芝孢子未載入藥典，尚未有靈芝孢子多糖含量測(cè)定法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。市售的靈芝孢子相關(guān)產(chǎn)品的多糖含量測(cè)定法，主要是企業(yè)根據(jù)中國(guó)藥典或《保健食品功效成分檢測(cè)方法》制定的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，不同方法測(cè)得多糖含量的差異較大。本文采用三種測(cè)定法分別對(duì)十批靈芝孢子進(jìn)行多糖含量測(cè)定，比較不同方法的差異［8，9］，為標(biāo)準(zhǔn)化靈芝孢子多糖含測(cè)的必要性提供了依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器BS210S型電子天平（德國(guó)Sartorius）、SHIMADZU UV-2550（島津杭州）、HHS型電熱恒溫油浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、W201B恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）、LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)（上海棱譜儀器儀表有限公司）

1.2試藥?kù)`芝孢子（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司）；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；相對(duì)分子質(zhì)量5×105的葡聚糖對(duì)照品（Sigama公司）；銅試劑溶液（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司）；乙醇、蒽酮、苯酚、硫酸、氫氧化鈉等均為分析純；水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1藥典法測(cè)定靈芝孢子中多糖含量

2.1.1對(duì)照品溶液的制備取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1 mL含0.114 mg的溶液，即得。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL，分別置10mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱(chēng)取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（通則0401），在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1、圖1。

表1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.3供試品溶液的制備取靈芝孢子，破壁，精密稱(chēng)取破壁孢子粉2 g，置圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h，加熱回流4 h，趁熱濾過(guò)，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過(guò)，合并濾液，置水浴上蒸干，殘?jiān)盟?.5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇37.5 mL，搖勻，在4℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液2 mL置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.4樣品測(cè)定精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。計(jì)算公式：多糖含量=（A樣品-0.05）÷5.3238× 312.5÷M樣品÷1000×100%；其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱(chēng)樣量（g）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　靈芝孢子粉的多糖含量測(cè)定結(jié)果

從表2結(jié)果可知，藥典蒽酮硫酸法測(cè)得10批靈芝孢子的多糖含量均值為2.05%。

2.2苯酚硫酸分光光度法測(cè)定靈芝孢子中多糖的含量［10］（1）對(duì)照品溶液的制備取無(wú)水葡萄糖適量，精密稱(chēng)定，加水制成每1 mL含0.03648 mg的溶液，即得。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0分別置于25 mL比色管中，補(bǔ)加水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入硫酸10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱2分鐘，取出，冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表3和圖2。

表3　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（3）供試品溶液的制備。取靈芝孢子，破壁，精密稱(chēng)取破壁孢子粉1.2 g，置100 mL錐形瓶中，加水約80 mL，于沸水浴中加熱1 h，冷卻至室溫，濾過(guò)。濾液置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，準(zhǔn)確吸取稀釋液2.0 mL，加入無(wú)水乙醇8.0 mL，混勻，于4℃冰箱靜置4 h以上，以4000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘?jiān)?0%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心棄去上清液，反復(fù)操作3次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ?0 mL，搖勻，即得。

（4）樣品測(cè)定。精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL比色管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。計(jì)算公式：

其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱(chēng)樣量（g）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　靈芝孢子粉中多糖的含量

從表4結(jié)果可知，苯酚硫酸法測(cè)得10批靈芝孢子的多糖含量均值為2.72%。

2.3葡聚糖分光光度法測(cè)定靈芝孢子中多糖的含量［10］（1）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制準(zhǔn)確稱(chēng)取相對(duì)分子量5×105已干燥至恒重的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品0.10225 g，加水溶解，并定容至10 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.225 mg葡聚糖。

（2）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液配制吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖0.10225 mg。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。準(zhǔn)確吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 ml，分別置25 ml比色管中，準(zhǔn)確補(bǔ)水至2.0ml，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，快速搖勻，快速加入濃硫酸10.0 ml，快速搖勻，置沸水浴中煮2 min，冷卻后用分光光度計(jì)在485 nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，1 cm比色皿測(cè)定吸光度值，以葡聚糖量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Au）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表5和圖3。

表5　葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（4）供試品溶液的制備。取靈芝孢子，破壁，精密稱(chēng)取破壁孢子粉18 g，加水100 mL，于沸水浴上加熱2 h，取出，放冷，濾過(guò)，濾液置100 mL量瓶中，加水稀釋至100 mL，搖勻，準(zhǔn)確吸取稀釋液2.0 mL置離心管中，加入無(wú)水乙醇8.0 mL，混勻5 min后，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘?jiān)?0%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去清液，反復(fù)操作3～4次，殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?.0 mL，搖勻，準(zhǔn)確吸取定容后溶液2.0 mL置離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以3000 r/min離心5 min，棄去上清液，殘?jiān)孟礈煲合礈?，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次，殘?jiān)?0%（體積分?jǐn)?shù)）硫酸溶液2.0 mL溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

（5）樣品測(cè)定。精密吸取供試品溶液2.0mL置25mL比色管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入50g/L苯酚溶液1.0mL”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡聚糖的含量，計(jì)算，即得。計(jì)算公式：

其中，A樣品是樣品的吸光度值（Au），M樣品為樣品的稱(chēng)樣量（g）。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　靈芝孢子粉中多糖含量測(cè)定

從表6結(jié)果可知，葡聚糖分光光度法測(cè)得10批靈芝孢子的多糖含量均值為1.09%。

3　討論

本文采用蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法和葡聚糖分光光度法測(cè)定十批靈芝孢子的多糖含量，發(fā)現(xiàn)不同測(cè)定方法測(cè)得的結(jié)果相差很大。廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊是在不添加任何輔料下，把破壁靈芝孢子粉加乙醇濕法制粒、干燥和填充所得的膠囊，其標(biāo)示的粗多糖含量大于0.6%，而保健食品數(shù)據(jù)庫(kù)中其他已有保健食品批文的同類(lèi)產(chǎn)品均標(biāo)示多糖含量較高，但這些產(chǎn)品的多糖測(cè)定方法未有公開(kāi)。廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊的多糖含量是采用葡聚糖分光光度法測(cè)定，所測(cè)得的是相對(duì)分子量較大的多糖，因此粗多糖的含量較低，但是筆者研究發(fā)現(xiàn)采用蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法測(cè)定廣藥牌破壁靈芝孢子粉膠囊的多糖含量均大于2.0%。因此，筆者認(rèn)為為了讓消費(fèi)者能選擇到真正質(zhì)量更好的靈芝孢子系列產(chǎn)品，在規(guī)定多糖含量時(shí)，應(yīng)該標(biāo)準(zhǔn)化多糖含量的測(cè)定方法。

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Comparison of Different Methods for Determination of Polysaccharide in Ganoderma Lucidum Spore

LUO Aiqin，CHEN Liang，LI Jing
（Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.，Ltd./National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of TCM，Guangzhou 510240，China）

Objective To compare three different methods for the determinationof polysaccharides in Ganoderma lucidum spore. Methods Determination methods in the 2015 edition of"China Pharmacopeia"and"Phenol-sulfuric acid spectrophotometric method for the determination of crude polysaccharide"and"Spectrophotometric Determination of dextran"of"Health food efficacy component detection method（Bai Hong）"were applied to assay Ganoderma lucidum spore polysaccharide content.Results The experiment results showed that the average percent contents of polysaccharide with determine methods of"China Pharmacopeia"，" Phenol-sulfuric acid spectrophotometric method for the determination of crudepolysaccharide"and"Spectrophotometric Determination of dextran"were 2.05%，2.72%and 1.09%，respectively，in the 10 batchs of Ganoderma lucidum spore.Conclusion There is a big difference among three different methods for the determination of Ganoderma lucidum spore polysaccharide content.

Ganoderma lucidum spore；polysaccharide；determination

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.19.058

1672-2779（2016）-19-0132-03

：李海燕本文校對(duì)：蔣兆健

2016-06-14）

廣州市科技惠民專(zhuān)項(xiàng)對(duì)口科技幫扶專(zhuān)題（No：2014Y2-00539）