林鳳云，羅 易，何雄偉（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 4011；2.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心，重慶 4011；.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700；4.重慶市第九人民醫(yī)院臨床藥學(xué)研究室，重慶 400700）

恩替卡韋-PLGA緩釋微球的處方優(yōu)化及體外釋藥研究Δ

林鳳云1，2＊，羅 易3，何雄偉4#（1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，重慶 401331；2.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心，重慶 401331；3.重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700；4.重慶市第九人民醫(yī)院臨床藥學(xué)研究室，重慶 400700）

目的：優(yōu)化恩替卡韋聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）緩釋微球的處方，并考察其體外釋藥特性。方法：采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備恩替卡韋-PLGA緩釋微球；以微球的包封率、載藥量的綜合評分為評價指標(biāo)，設(shè)計正交試驗(yàn)優(yōu)化投藥量、藥物-PLGA質(zhì)量比、PLGA質(zhì)量濃度、油相-水相體積比、聚乙烯醇（PVA）濃度，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)；考察所制微球形態(tài)、粒徑及體外釋藥情況（Q）。結(jié)果：最優(yōu)處方為恩替卡韋20 mg、恩替卡韋-PLGA質(zhì)量比1∶10、PLGA質(zhì)量濃度200 mg/ml、油相-水相體積比1∶10、PVA濃度2%。所制恩替卡韋-PLGA緩釋微球的包封率為（86.52±3.25）%，載藥量為（18.36±1.37）%，RSD均小于5.0%（n=3）；其表面光滑圓整，平均粒徑為58.35 μm；Q10 h、Q96 h、Q360 h分別為9.6%、42.9%、89.6%，體外釋藥符合Higuchi模型（r2=0.965 8）。結(jié)論：優(yōu)化處方所制恩替卡韋-PLGA緩釋微球的緩釋性能良好。

恩替卡韋；緩釋微球；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；體外釋藥；正交試驗(yàn)；制備；處方優(yōu)化

恩替卡韋（Entecavir，ETV）是當(dāng)前慢性乙型肝炎（CHB）患者抗病毒治療的一線藥物之一［1-2］，具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒（HBV）能力［3-4］。但ETV需每日口服，至少用藥半年，療程較長；同時為增強(qiáng)其吸收臨床要求患者空腹用藥，加劇了ETV的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、腹部不適和消化不良等，導(dǎo)致患者依從性差，治療效果不佳。另ETV停藥后會出現(xiàn)反跳現(xiàn)象，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，甚至發(fā)生肝衰竭，預(yù)后不佳［5-6］。本研究以生物可降解新型材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Polylacticco-glycolic acid，PLGA）為基質(zhì)，將ETV制備成微球（MS）制劑（ETV-PLGA-MS），以期延長ETV的釋藥時間、提高生物利用度、減少藥品不良反應(yīng)、減少給藥次數(shù)及藥物對胃腸道的刺激，進(jìn)而提高藥物治療效果，改善患者的依從性，提高患者的生活質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Series PC4060高效液相色譜儀（美國蘭博公司）；DV215CD電子天平（美國奧豪斯公司）；S-3400N電子掃描顯微鏡（日本Hitachi公司）；XW-80漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；LS 230激光粒度測定儀（美國Beckman公司）；78-1恒溫磁力攪拌器（上海旌派儀器有限公司）；TGL-16G臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

ETV原料藥（湖北新銀禾化工有限公司，批號：20150326，純度：99.0%）；PLGA［批號：20141128，丙交酯-乙交酯（LA-GA）：75∶25，相對分子質(zhì)量：15 000］；聚乙烯醇（PVA，批號：20141021，相對分子質(zhì)量：13 000～23 000，水解度：87%～89%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；磷酸二氫鉀、聚山梨酯80、疊氮化鈉、二氯甲烷等均為市售分析純或化學(xué)純。

1.3 透析袋

MD25透析袋（北京索萊寶有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ETV-PLGA-MS的制備[7]

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備ETV-PLGA-MS。精密稱取適量ETV和PLGA溶解于二氯甲烷中，渦旋混勻，得到油相。將油相在冰浴條件下緩慢滴加至含有乳化劑PVA的水溶液（水相）中，同時以1 000 r/min攪拌20 min，再在室溫以400 r/min繼續(xù)攪拌6 h，揮發(fā)有機(jī)溶劑，靜置沉淀。純化水離心洗滌3次，減壓干燥48 h，得到粉末狀固體ETV-PLGA-MS。

2.2 ETV含量測定

2.2.1 色譜條件 采用高效液相色譜法測定ETV含量［8-9］。色譜柱：Diamonsil ODS-C1（8200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02%（V/V）的三氟乙酸水溶液-乙腈（95∶5）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃ 。在該色譜條件下，理論板數(shù)按ETV計不低于3 000。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取ETV 25 mg，置于100 ml量瓶中，加流動性適量，超聲溶解并定容，搖勻，制成250 μg/ml的貯備液。精密移取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、3.0、5.0 ml的貯備液，置于25 ml量瓶中，流動相定容，得到質(zhì)量濃度分別為1、3、5、8、10、30、50 μg/ml的系列溶液。精密量取上述溶液各20 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積。以溶液質(zhì)量濃度（c）對峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=267 634c+18 523（r2= 0.999 8）。結(jié)果表明，ETV質(zhì)量濃度在1～50 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度考察 精密量取高、中、低質(zhì)量濃度（10、5、1 μg/ml）的ETV溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件，同日內(nèi)測定5次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，考察日間精密度。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度ETV溶液的日內(nèi)RSD分別為0.22%、0.54%、0.36%（n=5），日間RSD分別為1.10%、0.75%、0.99%（n=5）。

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 精密量取高、中、低質(zhì)量濃度（10、5、1 μg/ml）的ETV溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算對應(yīng)的質(zhì)量濃度，以測得值與加入量之比計算回收率。結(jié)果，高、中、低質(zhì)量濃度的ETV溶液的平均回收率分別為99.81%、99.56%、99.05%（RSD分別為0.48%、0.44%、0.35%，n=3），表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3 載藥量和包封率的測定

精密稱取約20 mg ETV-PLGA-MS，置于離心管中，加入5 ml流動相，渦旋使其充分溶解?；鞈乙阂? 500 r/min（離心半徑6.5 cm）離心10 min，重復(fù)3次，合并上清液，用流動相定容至25 ml。按“2.2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，根據(jù)回歸方程計算ETV質(zhì)量濃度，按公式計算載藥量和包封率。載藥量（%）= MS中藥物的質(zhì)量/MS的質(zhì)量×100%，包封率（%）=MS中藥物的質(zhì)量/投藥量×100%。

2.4 ETV-PLGA-MS的處方優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對MS制備和性質(zhì)影響較顯著的5個因素作為考察對象，即投藥量（A，mg）、藥物-PLGA質(zhì)量比（B）、PLGA質(zhì)量濃度（C，mg/ml）、油相-水相體積比（D）、PVA濃度［E，%（mg/100 ml）］。每個因素選擇4個水平，按正交設(shè)計表L16（45）設(shè)計正交試驗(yàn)方案。以MS的載藥量（Y1）、包封率（Y2）為考察指標(biāo)，根據(jù)各指標(biāo)因素對制備工藝的影響大小分配權(quán)重系數(shù)，計算兩個因素的綜合評分Y=50%×Y1+50%×Y2，以其進(jìn)行綜合評價［10］，優(yōu)選處方。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

由表2和表3可知，各因素對Y的影響大小順序?yàn)锽＞E＞C＞D＞A，其中B有顯著影響（P＜0.05）。確定最優(yōu)處方為A2B2C3D2E4，即ETV投藥量為20 mg，ETV-PLGA質(zhì)量比為1∶10，PLGA質(zhì)量濃度為200 mg/ml，油相-水相體積比為1∶10，PVA濃度為2%。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)處方制備3批ETV-PLGA-MS，測定其包封率、載藥量。結(jié)果，ETV-PLGA-MS的平均包封率為（86.52±3.25）%、平均載藥量為（18.36±1.37）%、Y的平均值為（52.44±4.95）%、RSD均小于5.0%（n=3），表明本處方工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

2.6 ETV-PLGA-MS的形態(tài)觀察和粒徑分布考察

以掃描電子顯微鏡觀察優(yōu)化處方制備的ETV-PLGA-MS的形態(tài)，以激光粒度測定儀測定其粒徑大小及其分布。結(jié)果，ETV-PLGA-MS球形圓整，表面光滑、致密、無裂縫，平均粒徑為58.35 μm，粒徑分布為10.3～92.2 μm，可見其粒徑分布較窄。ETV-PLGA-MS的形態(tài)圖見圖1，粒徑分布圖見圖2。

圖1 ETV-PLGA-MS的形態(tài)圖（×950）Fig 1 Morphological of entecavir PLGA sustained-release microspheres（×950）

圖2 ETV-PLGA-MS的粒徑分布圖Fig 2 Particle size distribution of entecavir PLGA sustained-release microspheres

2.7 ETV-PLGA-MS體外釋放性能[11]

取優(yōu)化處方制備的干燥ETV-PLGA-MS 30 mg，精密稱定，置于透析袋中，加2 ml釋放介質(zhì)，釋放介質(zhì)為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，含0.02%疊氮鈉和1%聚山梨酯80）。釋放樣品置于裝有適量釋放介質(zhì)的具塞錐形瓶中，加入磁力攪拌子，于（37±0.5）℃ 的恒溫磁力攪拌器中，以轉(zhuǎn)速50 r/min攪拌。分別于0.5、1、10、24、48、72、96、120、168、216、312、360、432、480、600、720 h各取出1 m（l同時補(bǔ)加等量新鮮同溫釋放介質(zhì)），按“2.2.1”項(xiàng)下條件測定峰面積，計算累積釋放度（Q）。ETVPLGA-MS的體外釋放曲線見圖3。

圖3 ETV-PLGA-MS的體外釋放曲線Fig 3 Drug release in vitro profile of entecavir PLGA sustained-release microspheres

由圖3可知，ETV-PLGA-MS的Q10 h為9.6%，表明無突釋現(xiàn)象；Q96 h、Q360 h分別為42.9%、89.6%，說明ETV-PLGA-MS有較好的緩釋性能。將試驗(yàn)結(jié)果按零級、一級、Higuchi方程進(jìn)行擬合。結(jié)果，ETV-PLGA-MS的釋放更符合Higuchi方程，擬合結(jié)果見表4。

表4 ETV-PLGA-MS的體外釋藥方程擬合結(jié)果Tab 4 Fitting results of drug release in vitro of entecavir PLGAsustained-release microspheres

3 討論

注射用緩釋微球是近年來發(fā)展的一種新劑型，即將藥物分散或吸附在高分子聚合物基質(zhì)中，形成粒徑為1～300 μm的固體顆粒分散體系，可在體內(nèi)緩釋30 d以上。注射用微球作為一種新型給藥技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)主要有：（1）通過調(diào)節(jié)和控制藥物的釋放速度實(shí)現(xiàn)長效給藥的目的；（2）注射入組織內(nèi)，可達(dá)到靶向治療的目的，且微球與某些細(xì)胞組織有特殊的親和性，能被組織器官的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所吞噬，從而實(shí)現(xiàn)靶向性；（3）減少藥物對胃腸的刺激，改善首關(guān)效應(yīng)，提高生物利用度，降低給藥劑量［12-13］。

PLGA是一種性能優(yōu)良的合成高分子材料，可作為多種藥物緩釋載體，其優(yōu)點(diǎn)包括生物相容性好、安全性高［14-16］。

本研究以乳化-溶劑揮發(fā)法制備ETV-PLGA-MS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有較高的載藥量和包封率，微球形態(tài)圓整，粒徑均勻，可緩釋480 h以上，體外釋放符合Higuchi模型，符合注射用緩釋微球的體外釋放要求。

鑒于注射用微球制劑的質(zhì)量要求較高，在今后的工作中，還應(yīng)對該微球的體內(nèi)藥動學(xué)、藥效學(xué)和注射刺激性作進(jìn)一步研究，并考察丙交酯、乙交酯不同比例及不同分子質(zhì)量的PLGA對藥物釋放和緩釋性能的影響，進(jìn)一步闡明ETV-PLGA-MS的緩釋特性，探討其作為緩釋注射劑治療HBV感染的可行性。

［1］中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南：2010年版［J］.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12（1）：1.

［2］Liaw YF，Kao JH，Piratvisuth T，et al.Asian-pacific consensus statement on the management of hronic hepatitis B：a 2012 update［J］.Hepatol Int，2012，6（3）：531.

［3］Tenney DJ，Rose RE，Baldick CJ，et al.Long-term monitoring shows hepatitis B virus resistance to entecavir in nucleoside-na?ve patients is rare through 5 years of therapy ［J］.Hepatology，2009，49（5）：1 503.

［4］楊潔.恩替卡韋的藥效學(xué)特征及抗乙型肝炎病毒試驗(yàn)薈萃［J］.中國藥房，2015，26（8）：1 150.

［5］恩替卡韋臨床應(yīng)用專家委員會.恩替卡韋臨床應(yīng)用專家共識：2015年更新［J］.臨床肝膽病雜志，2016，32（1）：32.

［6］劉碧霞，張倫理，李小鵬，等.慢性乙型肝炎不規(guī)范停用恩替卡韋復(fù)發(fā)后再次恩替卡韋治療的效果［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2015，36（8）：1 263.

［7］張華，王翔，王學(xué)清，等.利培酮微球的制備和體外性質(zhì)評價［J］.中國新藥雜志，2013，22（20）：2 423.

［8］劉巖，孫英華，王尚，等.HPLC法測定恩替卡韋的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)［J］.中國藥劑學(xué)雜志，2014，12（6）：201.

［9］李瑞芳，程秀民.自制恩替卡韋片與上市對照制劑體外溶出度對比研究［J］.藥物分析雜志，2011，31（7）：1 333.

［10］周雪，薛雨晨，賀智勇，等.阿司匹林PEG-PLGA緩釋微球的制備以及體外釋藥的考察［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34（22）：1 889.

［11］郭寧子，辛中帥，楊化新.微球制劑質(zhì)量控制研究進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2015，24（18）：2 115.

［12］ Jóhannesson G，Stefánsson E，Loftsson T.Microspheres and nanotechnology for drug delivery［J］.Dev Ophthalmol，2016，doi：10.1159/000434693.

［13］Kleinstreuer C，F(xiàn)eng Y，Childress E.Drug-targeting methodologies with applications：a review［J］.World J Clin Cases，2014，2（12）：742.

［14］Gala-García A，Carneiro MB，Silva GA，et al.In vitro and in vivo evaluation of the biocompatibility of a calcium phosphate/poly（lactic-co-glycolic acid）composite［J］.J Mater Sci Mater Med，2012，23（7）：1 785.

［15］ Ford Versypt AN，Pack DW，Braatz RD.Mathematical modeling of drug delivery from autocatalytically degradable PLGA microspheres：a review［J］.J Control Release，2013，165（1）：29.

［16］ Lin CY，Lin SJ，Yang YC.Biodegradable polymeric microsphere-based vaccines and their applications in infectious diseases［J］.Hum Vaccin Immunother，2015，11（3）：6 500.

Study on the Formulation Optimization of Entecavir PLGA Sustained-release Microspheres and Its Drug Release in vitro

LIN Fengyun1，2，LUO Yi3，HE Xiongwei4（1.School of Pharmacy，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；2.Engineering Research Center of Chongqing Pharmaceutical Sciences，Chongqing 401331，China；3.Dept.of Pharmacy，the Ninth People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 400700，China；4.Dept.of Clinic Pharmacy Laboratory，the Ninth People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 400700，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of entecavir PLGA sustained-release microspheres，and explore its drug release in vitro.METHODS：PLGA sustained-release microspheres was prepared by emulsification-solvent evaporation method.Using composite score of entrapment efficacy and drug loading as indexes，orthogonal test was designed to optimize drug amount，drug-PLGA mass ratio，PLGA mass concentration，oil phase-aqueous phase volume ratio and polyvinyl alcohol（PVA）concentration；and validation test was also conducted.The prepared microsphere morphology，particle size and durg release in vitro were detected.RESULTS：The optimized formulation was entecavir 20 mg，entecavir-PLGA mass ratio 1∶10，PLGA mass concentration 200 mg/ml，oil phase-aqueous phase volume ratio 1∶10，and PVA concentration 2%；entrapment efficacy was（86.52±3.25）%，drug loading was（18.36±1.37）%，RSDs were lower than 5.0%（n=3）；it was round and smooth in appearance with average particle size of 58.35 μm；Q10 h，Q96 hand Q360 hwere 9.6%，42.9%and 89.6%，and the drug release in vitro fitted to Higuchi model （r2=0.965 8）.CONCLUSIONS：Entecavir PLGA sustained-release microspheres prepared by optimized formulation has good sustained-release performance.

Entecavir；Microspheres；PLGA；Drug release in vitro；Orthogonal test；Preparation；Formulation optimization

R943

A

1001-0408（2016）25-3549-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.28

2016-03-07

2016-04-07）

（編輯：鄒麗娟）

重慶市醫(yī)學(xué)科研計劃項(xiàng)目（No.2013-2-153）；重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校校級科研計劃項(xiàng)目（No.ygz2013101）

＊講師，碩士。研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。E-mail：linfengyun2009@126.com

副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail：1462683447@qq.com