黃 妍，曾 昆，徐 彪（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院西院區(qū)急診內(nèi)科，武漢 430030）

氨甲酰促紅細胞生成素對糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的影響Δ

黃 妍＊，曾 昆，徐 彪（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院西院區(qū)急診內(nèi)科，武漢 430030）

目的：研究氨甲酰促紅細胞生成素（CEPO）對糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的影響。方法：取大鼠隨機分為空白對照組、模型組和CEPO低、中、高劑量組（500、1 000、2 000 u/kg），每組12只，后4組大鼠建立糖尿病模型；各組大鼠ip相應藥物，每周2次，連續(xù)4周后分離冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠外周血清中前列環(huán)素（PGI2）、血管收縮因子內(nèi)皮素1（ET-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管性血友病因子（vWF）的水平；體外CCK8試驗檢測內(nèi)皮細胞活力（OD值）；實時定量聚合酶鏈式反應檢測內(nèi)皮細胞中增殖相關(guān)基因（Ki67、p16）、凋亡相關(guān)基因（Bad、Bax）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和AngⅠ的表達。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平均增加，內(nèi)皮細胞OD值降低，Ki67、p16、Bax、VEGF表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，CEPO低、中、高劑量組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平均減少，內(nèi)皮細胞OD值增加，Ki67、p16、VEGF表達增強，Bad、Bax表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其余差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：CEPO可能通過上調(diào)冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞VEGF表達，促進冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞再生，從而改善大鼠糖尿病冠脈微循環(huán)功能。

氨甲酰促紅細胞生成素；糖尿病；冠脈微循環(huán)；內(nèi)皮細胞；大鼠

糖尿病是現(xiàn)今威脅人類健康的主要疾病之一，其中糖尿病并發(fā)癥是降低患者預后效果的重要因素［1］，心腦血管并發(fā)癥是導致糖尿病患者死亡的最常見原因。雖然口服降糖藥物及胰島素可大大緩解患者的病情，但仍存在較多副作用。因此，制訂預防和治療糖尿病的有效策略有著重要的意義。

促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）是由腎小管周圍間質(zhì)細胞以及肝細胞所分泌的一腎源性激素，其主要生理作用是促進機體骨髓造血。研究發(fā)現(xiàn)，EPO還具有包括組織保護、促進組織損傷的修復，以及促進血管內(nèi)皮再生等眾多生理作用［2］。但長期或大劑量使用EPO，可引起骨髓造血系統(tǒng)過度刺激，以致紅細胞過度增多，引起循環(huán)血液高凝、血栓以及高血壓等并發(fā)癥，聯(lián)合用于糖尿病患者還可能加重患者病情的惡性程度［3-4］。氨甲酰促紅細胞生成素（CEPO）是EPO的一種衍生物［5］，其與EPO擁有相同的生理效應、藥動學等特點，但卻可避免過度刺激骨髓所致的并發(fā)癥。研究顯示，CEPO可有效改善糖尿病模型大鼠心功能，具有保護心肌、改善心肌功能、抗心肌纖維化、抑制炎癥反應以及抗凋亡的作用［6］。機體心功能的維持有賴于心肌活力與冠脈微循環(huán)的共同配合，而心肌生理活動又依賴于微循環(huán)的暢通。因此，本研究針對糖尿病心肌病，以大鼠2型糖尿病為模型，通過生理、細胞分子生物學實驗，探究CEPO對糖尿病模型大鼠心肌病冠脈微循環(huán)的影響，以期為后續(xù)糖尿病心肌病的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UV1901型紫外分光光度儀（中國北京普析公司）；9700型二代實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測儀（德國賽默飛世爾公司）；FV500型激光共聚焦掃描顯微鏡（日本Olympus公司）；羅康全型血糖儀（德國羅氏公司）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測儀、Thermo Multiskan FC全自動酶標儀（德國賽默飛世爾公司）

1.2 藥品與試劑

CEPO（德國Warren Pharmaceuticals公司，批號：CCG8657，化學純）；鏈脲佐菌素（STZ，批號：5637）、胎牛血清（FBS，批號：SZ231）和前列環(huán)素（PGI2）（批號：56745）、血管收縮因子內(nèi)皮素1（ET-1，批號：56234）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ，批號：56712）、血管性血友病因子（vWF，批號：56423）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均為美國Gibco公司產(chǎn)品；Trizol核酸裂解液（批號：8901256）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CD156）、RT-PCR試劑（批號：QH890）、CCK8細胞增殖檢測試劑盒（批號：HJ789054）均為碧云天生物科技有限公司產(chǎn)品；增殖相關(guān)基因Ki67、p16和凋亡相關(guān)基因Bad、Bax以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、AngⅠ引物及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物均購于中國華大生物技術(shù)有限公司。

1.3 動物

健康Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量為220～240 g，購買于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，合格證號為SCXK（鄂）2009-0002。

2 方法

2.1 糖尿病模型的建立

取大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周，隨即禁食12 h，稱體質(zhì)量并抽取尾靜脈血，測定血糖。然后分別ip 50 mg/kg的STZ，空白對照組大鼠ip等量生理鹽水，高糖高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)1周后再次重復給藥，取靜脈血測定血糖。如果血糖值＞18 mmol/ L，表明大鼠糖尿病模型建立成功。本次研究成功建立模型大鼠64只。

2.2 分組與給藥

取大鼠隨機分為空白對照組、模型組和CEPO低、中、高劑量組（500、1 000、2 000 u/kg），每組12只，其中CEPO中劑量按臨床常用日劑量換算而得。后4組大鼠按“2.1”項下方法建立糖尿病模型，然后各組大鼠ip相應藥物，空白對照組和模型組大鼠ip等量生理鹽水，每周2次，連續(xù)給藥4周。

2.3 冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的分離與培養(yǎng)

連續(xù)給藥4周后，取各組大鼠心臟，顯微鏡下分離微循環(huán)組織，于37 ℃、5%CO2條件下的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察組織周圍細胞向外周生長情況。

2.4 ELISA法檢測外周血清中微循環(huán)標志物水平

用包被緩沖液將已知抗原（PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF）稀釋至10 μg/ml，4 ℃過夜。次日加各組大鼠的血清0.1 ml于上述已包被的反應孔中，37 ℃孵育1 h；加入新鮮稀釋的酶標二抗0.1 ml，37 ℃孵育30 min；加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液0.1 ml，37 ℃孵育10 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml，在ELISA檢測儀450 nm波長處測定光密度（OD值）。同時測定PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF標準品OD值，繪制標準曲線，計算各組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平。

2.5 CCK8法檢測冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞活力

原代分離并培養(yǎng)冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞，待其生長穩(wěn)定后，提前1 d以30%密度接種于96孔板，3 d后以1∶10的比例加入CCK8試劑，37 ℃孵育2 h。吸取上清液，紫外分光光度儀檢測450 nm下OD值，以此評價各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的細胞活力。

2.6 RT-PCR法檢測冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bad、Bax、VEGF、AngⅠ的表達

細胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）洗滌2次，胰蛋白酶消化后收集對數(shù)期冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞，加入適量Trizol核酸裂解液，冰上孵育15 min，12 000×g離心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于DEPC水，－70 ℃保存。提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行熒光定量PCR反應。反應條件：95 ℃預變性10 min，（95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）×40循環(huán)，72 ℃末次延伸5 min。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔct法（ct為目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所需的循環(huán)數(shù)）進行相對定量分析，檢測各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bad、Bax及VEGF、AngⅠ的表達。具體引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primers of the genes

2.7 統(tǒng)計學方法

采用Graph Pad 6.0軟件進行分析。檢測資料主要為計量數(shù)據(jù)，以±s表示。多組間比較為單因素方差分析與HSD-q多重比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 外周血清中微循環(huán)標志物水平變化

與空白對照組比較，模型組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，CEPO低、中、高劑量組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平均減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中中劑量組效果最明顯（P＜0.05）。提示，CEPO可改善糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)功能。各組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平的檢測結(jié)果見表2。

3.2 冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞活力變化

結(jié)果表明，空白對照組、模型組和CEPO低、中、高劑量組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的OD值分別為11.79±0.59、7.92± 0.3、11.49±0.70、11.43±0.80、11.58±0.89，F(xiàn)=41.367，P= 0.000。與空白對照組比較，模型組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，CEPO低、中、高劑量組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞活力增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這提示，CEPO可促進糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的體外增殖。

表2 各組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平的檢測結(jié)果（±s，n=12，ng/L）Tab 2 Detection results of the levels of PGI2，ET-1，AngⅡand vWF in rat peripheral serum in each group（x± s，n=12，ng/L）

表2 各組大鼠外周血清中PGI2、ET-1、AngⅡ、vWF水平的檢測結(jié)果（±s，n=12，ng/L）Tab 2 Detection results of the levels of PGI2，ET-1，AngⅡand vWF in rat peripheral serum in each group（x± s，n=12，ng/L）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與CEPO低劑量組比較，ΔP＜0.05；與CEPO中劑量組比較，▲P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.CEPO low-dose group，ΔP＜0.05；vs.CEPO medium-dose group，▲P＜0.05

vWF 5.20±0.91 8.62±0.30＊5.88±0.10＊#5.08±0.90#Δ5.59±0.10#▲72.391 0.000組別空白對照組模型組CEPO低劑量組CEPO中劑量組CEPO高劑量組F P PGI2 4.21±0.40 11.84±0.80＊6.89±0.10＊#5.09±0.10＊#Δ6.90±0.10＊#▲625.822 0.000 ET-1 0.70±0.10 7.30±0.91＊4.89±0.10＊#3.11±0.51＊#Δ4.70±0.10＊#▲319.839 0.000 AngⅡ5.19±0.90 13.13±1.49＊8.01±0.30＊#6.27±0.10＊#Δ7.78±0.20＊#▲176.580 0.000

3.3 冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中增殖相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達變化

與空白對照組比較，模型組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bax表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，CEPO低、中、高劑量組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16表達增強，Bad、Bax表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bad、Bax表達的檢測結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bad、Bax表達的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 3 Detection results of the expressions of Ki67，p16，Bad and Bax in coronary microcirculation endothelial cells in each group（±s，n=12）

表3 各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中Ki67、p16、Bad、Bax表達的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 3 Detection results of the expressions of Ki67，p16，Bad and Bax in coronary microcirculation endothelial cells in each group（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與CEPO低劑量組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.CEPO low-dose group，ΔP＜0.05

Bax 18.83±3.19 12.46±0.68＊11.57±0.70＊#8.38±1.25＊#Δ8.20±1.32＊#Δ146.235 0.000組別空白對照組模型組CEPO低劑量組CEPO中劑量組CEPO高劑量組F P Ki67 11.08±0.30 8.50±0.20＊19.56±2.00＊#20.45±2.01＊#22.28±3.22＊#131.360 0.000 p16 10.01±0.33 8.10±0.17＊19.13±2.59＊#18.73±2.20＊#20.04±2.46＊#146.787 0.000 Bad 19.19±3.37 16.95±1.19 10.25±0.70＊#8.47±1.38＊#Δ8.61±1.79＊#128.963 0.000

3.4 冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF、AngⅠ表達變化

與空白對照組比較，模型組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，CEPO低、中、高劑量組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中高劑量組效果最明顯（P＜0.05）；各組間AngⅠ表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF、AngⅠ表達的檢測結(jié)果見表4。

4 討論

在糖尿病眾多的并發(fā)癥中，心肌病占全部并發(fā)癥的三分之一［7-10］。因此，尋找合理有效的干預措施、可逆性逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌病，具有重要的社會及醫(yī)學價值。糖尿病心肌病主要由血糖升高所致心肌損傷及冠脈微循環(huán)低灌注兩方面因素共同造成。由于心肌活動在極大程度上依賴微循環(huán)血氧、營養(yǎng)素的供應及代謝產(chǎn)物的運出［11-12］，因此，恢復冠脈微循環(huán)是改善心肌活力的重要途徑。

表4 各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF、AngⅠ表達的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 4 Detection results of the expressions of VEGF and AngⅠin coronary microcirculation endothelial cells in each group（±s，n=12）

表4 各組大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞中VEGF、AngⅠ表達的檢測結(jié)果（±s，n=12）Tab 4 Detection results of the expressions of VEGF and AngⅠin coronary microcirculation endothelial cells in each group（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與CEPO低劑量組比較，ΔP＜0.05；與CEPO中劑量組比較，▲P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.CEPO low-dose group，ΔP＜0.05；vs.CEPO medium-dose group，▲P＜0.05

AngⅠ14.77±1.20 14.24±1.78 14.45±2.49 13.90±2.01 15.07±1.72 0.354 0.839組別空白對照組模型組CEPO低劑量組CEPO中劑量組CEPO高劑量組F P VEGF 4.71±0.90 1.80±0.30＊12.47±1.39＊#13.59±1.21＊#16.00±0.71＊#Δ▲234.820 0.000

本研究發(fā)現(xiàn)，CEPO可促進糖尿病模型大鼠冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞體外增殖、改善模型大鼠冠脈微循環(huán)功能、上調(diào)VEGF表達。由于CEPO對機體的效應是全身性的，而特異性針對VEGF靶向微循環(huán)內(nèi)皮細胞，將有助于在治療糖尿病心肌病的同時，避免CEPO的其他未知副作用［13］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可顯著影響冠脈微循環(huán)內(nèi)皮細胞的增殖，結(jié)合糖尿病眾多并發(fā)癥基于微小血管病變的理論依據(jù)，筆者大膽猜測，CEPO還可能通過VEGF作用于其他微循環(huán)，譬如視網(wǎng)膜等，有待進一步研究。

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Effects of Carbamylated Erythropoietin on Coronary Microcirculation Endothelial Cells in Rats with Diabetes Mellitus

HUANG Yan，ZENG Kun，XU Biao（Dept.of Emergency Internal Medicine，West Hospital District of Pu’ai Hospital Affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

OBJECTIVE：To study the effects of carbamylated erythropoietin（CEPO）on cardiovascular microcirculation in rats with diabetes mellitus.METHODS：Rats were randomly divided into blank control group，model group，CEPO low-dose，mediumdose and high-dose groups（500，1 000，2 000 u/kg）with 12 in each group.The rats in the last 4 groups were reduced diabetes mellitus model.All rats were given relevant medicine intragastrically twice a week，coronary microcirculation endothelial cells were separated after consecutive 4 weeks.Enzyme-linked immunosorbent assay was conducted to detect levels of peripheral serum prostacyclin（PGI2），vasoconstrictor endothelin-1（ET-1），angiotensinⅡ（AngⅡ）and von Willebrand factor（vWF）of rats in each group；in vitro CCK 8 test was used to detect endothelial cell activity（OD value）；real-time quantitative polymerase chain reaction was adopted to detect proliferation-related genes（Ki67，p16），poptosis-related genes（Bad，Bax），and expressions of protein vascular endothelial growth factor（VEGF）and AngⅠ.RESULTS：Compared with blank control group，levels of PGI2，ET-1，AngⅡand vWF in serum in model group increased；OD value deceased；Ki67，p16，Bax and VEGF expression decreased；the difference was statistically significant（P＜0.05）.Compared with model group，levels of PGI2，ET-1，AngⅡ and vWF in serum in CEPO low-dose，medium-dose and high-dose groups increased；OD value increased；Ki67，p16 and VEGF expression increased；expressions of Bad and Bax decreased；the difference was statistically significant（P＜0.05）.The others had no significant difference（P＞0.05）.CONCLUSIONS：CEPO maybe improve the coronary microcirculation function by upregulating VEGF expression in coronary microcirculation endothelial cells and promoting endothelial cells’regeneration.

Carbamylated erythropoietin；Diabetes mellitus；Coronary microcirculation；Endothelial cells；Rat

R965

A

1001-0408（2016）25-3488-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.10

2016-03-28

2016-07-15）

（編輯：鄒麗娟）

武漢市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目（No.WX16B13）

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：心血管疾病。E-mail：huangyan8420@sina.com