梁錦鋒，朱勇，張洪瑤，勞喬聰，馬敏康，李春啟

(1.浙江省藥品化妝品審評中心，杭州　310012；2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州　310012)

?

斑馬魚模型在藥物研發(fā)早期腎臟毒性中的應用研究

梁錦鋒1*，朱勇1，張洪瑤1，勞喬聰2，馬敏康1，李春啟2

(1.浙江省藥品化妝品審評中心，杭州310012；2.杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州310012)

目的 利用斑馬魚模型評價注射用鹽酸萬古霉素和厄貝沙坦片的腎毒性。方法構建AB系斑馬魚腎臟模型，藥物處理受精后2 d(2 dpf)的斑馬魚至5 dpf，統(tǒng)計各實驗組斑馬魚腎性水腫發(fā)生率，判斷藥物是否具有腎毒性。結(jié)果萬古霉素在注射劑量為16.4 ng/尾(1/10 MNLD)時，斑馬魚發(fā)育正常，未見明顯的毒性；在注射劑量為54.7 ng/尾(1/3 MNLD)、164 ng/尾(MNLD)和273 ng/尾(LD10)時，斑馬魚腎性水腫發(fā)生率分別為3.3%、10%和10%，死亡率分別為0%、0%和16.7%，表明萬古霉素在注射劑量54.7 ng/尾(1/3 MNLD)至273 ng/尾(LD10)的范圍內(nèi)，有明顯的腎毒性。厄貝沙坦在濃度為8.3 μg/mL(1/10 MNLC)至91 μg/mL(LC10)范圍內(nèi)，斑馬魚腎臟均發(fā)育正常，未見腎毒性。結(jié)論斑馬魚腎毒性模型的建立，可用于藥物腎毒性的早期評價，并且精確評價了萬古霉素和厄貝沙坦的腎臟毒性。

斑馬魚；腎毒性；新藥研發(fā)；萬古霉素；厄貝沙坦

在藥物臨床前和臨床研究過程中，超過70%的新藥由于其本身的毒性和安全性等問題被淘汰。因此，建立快速、經(jīng)濟、有效的藥物早期安全性評價技術已成為國內(nèi)外新藥研發(fā)領域的研究熱點，在新藥研發(fā)過程中具有非常重要的意義。在新藥研發(fā)早期階段，體外細胞、分子生物學手段具有快速、高效、經(jīng)濟等特點，但是由于其過程在吸收、分布、代謝、排泄等方面與人體有較大的差異，在很大程度上不能替代體內(nèi)試驗。而常規(guī)的動物體內(nèi)實驗采用的動物模型如猴、犬、大小鼠等由于存在動物福利、實驗成本等問題，嚴重制約了其在早期篩選中的應用。

由于養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、胚胎體外受精、產(chǎn)卵量大、胚體透明，斑馬魚已成為生命科學研究中的新寵。在國際上，斑馬魚在生物學中逐漸使用于生命體的各種系統(tǒng)，如神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的發(fā)育[1-3]、功能和疾病的研究，已建立了神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病[4，5]、糖尿病[6]、腫瘤[7]、免疫系統(tǒng)疾病，造血系統(tǒng)疾病，先天缺陷等方面疾病的模型，并已廣泛應用于藥物的毒性研究[8-12]。

在腎毒性研究中，實驗人員使用斑馬魚建立了各種腎臟毒性模型[13-15]，包括腎毒性引起的局部水腫(心包水腫、眼水腫和腦水腫等) 或全身水腫模型，腎小球濾過障礙模型，肌酐檢測模型，以及基于基因構建的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型等。腎臟毒性的斑馬魚模型已經(jīng)廣泛使用于腎臟的發(fā)育機制及藥物腎臟毒性的機制及藥效學研究中。藥物誘導斑馬魚發(fā)生腎臟毒性時往往會引起腎臟的形態(tài)學的改變，因此本研究基于此建立了快速、高效的腎臟毒性早期檢測方法，為新藥的臨床前研究提供早期的安全性信息。

1　材料和方法

1.1實驗動物

野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配的方式進行交配。受精后2 d(2 dpf)挑選合適的胚胎進行給藥試驗。在28℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(每1L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為 480～510 μS/cm；pH 為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6 nmol/L CaCO3)。實驗完成后，用三卡因甲磺酸對各個發(fā)育階段的斑馬魚進行過度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死后進行相應檢測。

1.2主要試劑與儀器

注射用鹽酸萬古霉素，由Eli Lilly Japan K.K生產(chǎn)，批號C218774；厄貝沙坦片，由賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產(chǎn)，批號4A245；陽性對照藥物馬兜鈴酸購自于阿拉丁，批號A111318；解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；與顯微鏡相連的相機(TK-C1481EC, JVC, Japan)；顯微注射儀(IM-300，Narishige)，拉針儀(PC-10, Narishige, Japan)；精密電子天平(CP214，奧豪斯)。

1.3實驗方法

1.3.1藥物的LD10(LC10)和最大非致死劑量(MNLD)(最大非致死濃度(MNLC))測定

注射用鹽酸萬古霉素采用血液循環(huán)注射給藥，厄貝沙坦片采用溶解給藥，每個實驗組均處理30尾斑馬魚，注射用鹽酸萬古霉素的5個檢測劑量分別為：1000 ng/尾、500 ng/尾、250 ng/尾、125 ng/尾和62.5 ng/尾，厄貝沙坦片的濃度為0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL和1000 μg/mL；藥物處理結(jié)束后，統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數(shù)量，使用統(tǒng)計學軟件Origin 8.0繪制最佳的劑量效應曲線，并計算LD10和MNLD或LC10和MNLC。

1.3.2濃度或劑量設置

注射用鹽酸萬古霉素選取4個劑量或濃度進行檢測(注射給藥分別為LD10、MNLD、1/3 MNLD和1/10 MNLD，厄貝沙坦溶解給藥分別為LC10、MNLC、1/3 MNLC和1/10 MNLC)，濃度或劑量設置如表1所示。

表1　腎毒性評價實驗藥物濃度或劑量組別

1.3.3藥物對斑馬魚腎臟的影響

依據(jù)預試驗得到的藥物致死曲線，每種藥物選取4個劑量或濃度進行檢測(通常為LD10、MNLD、1/3 MNLD和1/10 MNLD或LC10、MNLC、1/3 MNLC和1/10 MNLC)；陽性對照組給以4 μM馬兜鈴酸，每個實驗組均處理30尾斑馬魚，藥物處理72 h后，每組隨機取10條斑馬魚觀察有無腎性水腫形成。對異常形態(tài)進行拍照，并統(tǒng)計腎性水腫發(fā)生率。

2　結(jié)果

2.1藥物的LD10(LC10)和最大非致死劑量(MNLD)(最大非致死濃度(MNLC))

根據(jù)各實驗組斑馬魚的死亡數(shù)(見表2)，使用Origin 8.0軟件繪制萬古霉素劑量致死曲線(圖1)，得到萬古霉素的MNLD為164 ng/尾，LD10為273 ng/尾。

根據(jù)各實驗組斑馬魚的死亡數(shù)(見表3)，使用Origin 8.0軟件繪制厄貝沙坦?jié)舛戎滤狼€(圖2)，得到厄貝沙坦的MNLC為83 μg/mL，LC10為91 μg/mL。

表2　萬古霉素處理的斑馬魚死亡率統(tǒng)計(n=30)

表3　厄貝沙坦處理的斑馬魚死亡率統(tǒng)計(n=30)

2.2不同藥物對斑馬魚腎性水腫的影響

2.2.1萬古霉素對斑馬魚腎性水腫的影響

萬古霉素在注射劑量為16.4 ng/尾(1/10 MNLD)時，斑馬魚發(fā)育正常，未見明顯的毒性；在注射劑量為54.7 ng/尾(1/3 MNLD)、164 ng/尾(MNLD)和273 ng/尾(LD10)時，斑馬魚腎性水腫發(fā)生率分別為3.3%、10%和10%，死亡率分別為0%、0%和16.7%，說明萬古霉素在注射劑量為54.7 ng/尾(1/3 MNLD)至273 ng/尾(LD10)的范圍內(nèi)，有明顯的腎毒性(表4，圖3-4)。

圖1　萬古霉素濃度致死曲線Fig.1　Vancomycin-induced dose-dependent zebrafish mortality

圖2　厄貝沙坦?jié)舛戎滤狼€Fig.2　Irbesartan-induced dose-dependent zebrafish mortality

2.2.2厄貝沙坦對斑馬魚腎性水腫的影響

厄貝沙坦在濃度為8.3 μg/mL(1/10 MNLC)至91 μg/mL(LC10)范圍內(nèi)，斑馬魚均發(fā)育正常，未見厄貝沙坦誘導腎毒性發(fā)生(表5，圖5-6)。

表4　萬古霉素對斑馬魚腎毒性的影響

注：(H)心臟；(Y)卵黃囊；(A)空白組；(B)4 μM馬兜鈴酸；(C)16.4 ng萬古霉素；(D)54.7 ng萬古霉素；(E)164 ng萬古霉素；(F)273 ng萬古霉素。圖3　萬古霉素誘發(fā)的毒性表型Note. (H) heart； (Y) yolk sac；(A)Blank；(B)4 μM Aristolochic acids；(C)16.4 ng vancomycin；(D)54.7 ng vancomycin；(E)164 ng vancomycin；(F)273 ng vancomycin.Fig.3　Visual observation of zebrafish after microinjection of vancomycin

注：(A)空白組；(B)4 μM馬兜鈴酸；(C)16.4 ng萬古霉素；(D)54.7 ng萬古霉素；(E)164 ng萬古霉素；(F)273 ng萬古霉素。圖4　萬古霉素誘發(fā)的腎性水腫(紅色箭頭指示腎性水腫)Note.(A)Blank；(B)4 μM Aristolochic acids；(C)16.4 ng vancomycin；(D)54.7 ng vancomycin；(E)164 ng vancomycin；(F)273 ng vancomycin.Fig.4　The renal edema induced by vancomycin (red arrows indicate renal edema)

表5　厄貝沙坦對斑馬魚腎毒性影響

注：(A)空白組；(B)4 μM馬兜鈴酸；(C)8.3 μg/mL厄貝沙坦；(D)27.7 μg/mL厄貝沙坦；(E)83 μg/mL厄貝沙坦；(F)91 μg/mL厄貝沙坦。圖6　厄貝沙坦的斑馬魚背光圖(紅色箭頭指示腎性水腫)Note.(A)Blank；(B)4 μM Aristolochic acids；(C)8.3 μg/mL irbesartan；(D)27.7 μg/mL irbesartan；(E)83μg/mL irbesartan；(F)91μg/mL irbesartan.Fig.6　Visual observation of zebrafish’s backside (red arrows indicate renal edema)

3　討論

斑馬魚作為較為常用的三大模式動物之一，是藥物早期安全性評價的理想模型。通過針對各類疾病發(fā)生發(fā)展的機制和藥物在其體內(nèi)產(chǎn)生毒性的機制研究，在斑馬魚上已建立了多種藥效學和臨床前安全性評價的模型和技術，通過這些模型和技術的使用，可以在藥物研發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)藥物的有效性和安全性，縮短新藥研發(fā)的周期，降低新藥研發(fā)的成本。

腎臟是人體最主要的排泄器官，極易受到體內(nèi)排泄的化合物的影響而引起腎臟損傷，腎臟毒性成為制約新藥研發(fā)的重要原因之一，針對腎臟毒性的新型模型的研究已成為藥物研發(fā)的熱點。通過對斑馬魚在腎臟毒性中的應用的調(diào)研，我們運用斑馬魚構建了基于形態(tài)改變的腎臟毒性的評價體系，并將其運用于藥物的腎臟毒性評價，這一發(fā)現(xiàn)為斑馬魚腎臟毒性模型在新藥研發(fā)中的應用提供了實驗支撐。

萬古霉素是治療耐甲氧西林金葡菌(MRSA)最常用的糖肽類抗生素，已有很長的使用歷史，是治療MRSA檢出的首選藥物。但是有大量的文獻報道提示萬古霉素具有顯著的腎臟毒性，其發(fā)生率較高。萬古霉素通過導致腎小管近曲端上皮細胞氧化應激反應引起腎臟毒性[16]。在本實驗中，萬古霉素在較低劑量下即可引起斑馬魚的腎性水腫，表現(xiàn)出明顯的腎臟毒性。

而在另一個藥物厄貝沙坦中，厄貝沙坦是新型血管緊張素Ⅱ受體的阻滯劑，可通過調(diào)整血流動力學，改善腎小球基底膜通透性，降低系膜細胞增生和小管間質(zhì)纖維化程度等對腎臟產(chǎn)生保護作用[17]。在本實驗中，厄貝沙坦的所有給藥濃度下均未發(fā)現(xiàn)腎性水腫發(fā)生，表明厄貝沙坦無明顯腎臟毒性作用，這也與其在臨床上對腎臟的保護作用一致。

通過本實驗的開展，我們發(fā)現(xiàn)了以斑馬魚為載體的早期腎臟毒性評價模型和技術，有利于斑馬魚研究領域的進一步擴展及新藥的臨床前早期評價。

[1]Choi SY, Baek JI, Zuo X,etal. Cdc42 and sec10 Are Required for Normal Retinal Development in Zebrafish[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci., 2015, 56(5):3361-3370.

[2]Hong H, Shen R, Liu W,etal. Developmental toxicity of three hexabromocyclododecane diastereoisomers in embryos of the marine medaka Oryzias melastigma[J]. Mar Pollut Bull, 2015, 101(1):110-118.

[3]Nishimura Y, Inoue A, Sasagawa S,etal. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing[J]. Congenit Anom (Kyoto), 2016, 56(1):18-27.

[4]Vornanen M, Hassinen M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology[J]. Channels (Austin), 2016，10(2)：101-110.

[5]Seto SW, Kiat H, Simon M,etal. Zebrafish models of cardiovascular diseases and their applications in herbal medicine research[J]. European Journal of Pharmacology, 2015, 768:77-86.

[6]Sarras MP, Leontovich AA, Intine RV. Use of zebrafish as a model to investigate the role of epigenetics in propagating the secondary complications observed in diabetes mellitus[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol, 2015, 178:3-7.

[7]Zhang B, Shimada Y, Hirota T,etal. Novel immunologic tolerance of human cancer cell xenotransplants in zebrafish[J]. Transl Res, 2016，70:89-98.

[8]Boran H, Ulutas G. Genotoxic effects and gene expression changes in larval zebrafish after exposure to ZnCl2 and ZnO nanoparticles[J]. Dis Aquat Organ, 2016, 117(3):205-214.

[9]Veldman MB, Rios-Galdamez Y，Lu XH,etal. The N17 domain mitigates nuclear toxicity in a novel zebrafish Huntington’s disease model[J]. Mol Neurodegener, 2015，10:67.

[10]Oulmi Y, Braunbeck T. Toxicity of 4-chloroaniline in early life-stages of zebrafish (Brachydanio rerio): I. cytopathology of liver and kidney after microinjection[J]. Arch Environ Contam Toxicol, 1996, 30(3):390-402.

[11]Gao Y, Feng J, Zhu L. Prediction of acute toxicity of cadmium and lead to zebrafish larvae by using a refined toxicokinetic-toxicodynamic model[J]. Aquat Toxicol, 2015, 169:37-45.

[12]Yang Y, Qi S, Wang D,etal. Toxic effects of thifluzamide on zebrafish (Danio rerio) [J]. J Hazard Mater, 2016, 307:127-136.

[13]Berman N, Lectura M, Thurman JM,etal. A zebrafish model for uremic toxicity: role of the complement pathway[J]. Blood Purif, 2013, 35(4):265-269.

[14]Hentschel DM, Park KM, Cilenti L,etal. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2005, 288(5):923-929.

[15]McKee AR, Wingert AR. Zebrafish Renal Pathology: Emerging Models of Acute Kidney Injury[J]. Curr Pathobiol Rep, 2015, 3:171-181.

[16]Bruniera FR, Ferreira FM, Savioli LR,etal. Endothelial, renal and hepatic variables in Wistar rats treated with Vancomycin[J]. An Acad Bras Cienc, 2014, 86(4):1963-1972.

[17]Yu QX, Zhang H, Xu WH,etal. Effect of Irbesartan on Chemerin in the Renal Tissues of Diabetic Rats[J]. Kidney Blood Press Res, 2015, 40(5):467-477.

Study on the application of zebrafish model in the early stage of renal toxicity in drug development

LIANG Jin-feng1*，ZHU Yong1，ZHANG Hong-yao1，LAO Qiao-cong2，MA Min-kang1，LI Chun-qi2

(1.Zhejiang Center for Drug and Cosmetic Evaluation，Hangzhou 310012，China；2.Hangzhou Hunter Biotechnology,Inc, Hangzhou 310012,China)

Objective To evaluate the renal toxicity of vancomycin hydrochloride and irbesartan tablets using the zebrafish model. Methods After construction of AB zebrafish kidney model, the fish were treated with drug after fertilization 2 days (2 dpf) to 5 dpf. At the end of the experiment, the number of renal edema zebrafish was counted in each experimental group to evaluate the renal toxicity of drugs. ResultsThe zebrafish development was normal and no obvious toxicity at the dose of 16.4 ng/fish (1/10 MNLD)for vancomycin, and zebrafish renal edema occurred rate was 3.3%, 10% and 10% respectively at the dose of 54.7 ng/fish (1/3 MNLD), 164 ng/fish (MNLD) and 273 ng/fish (LD10) with the death rate of 0%, 0% and 16.7%, respectively, which indicated that there was significant renal toxicity of vancomycin at the dose of 54.7 ng/fish (1/3MNLD) to 273 ng/fish (LD10). Irbesartan didn’t induce renal toxicity at the dose of 8.3 μg/mL (1/10 MNLC) to 91 μg/mL (LC10). ConclusionsThe zebrafish model of renal toxicity can be used for the early evaluation of drug renal toxicity and we made evaluation of the renal toxicity of vancomycin and irbesartan with this model.

Zebrafish; Renal toxicity; New drug evaluation; Vancomycin; Irbesartan

浙江省食品藥品監(jiān)管系統(tǒng)科技計劃項目(2014002)。

梁錦鋒(1976-)男，博士，高級工程師，研究方向：新藥技術審評和藥品再評價。E-mail: liangwind@sohu.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0030-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.006

2016-03-09