王晨陽, 曹海濤*，張志華，華川

(1.解放軍第252醫(yī)院動物實驗室，河北 保定　071000； 2.解放軍第252醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 保定　071000；3.解放軍第252醫(yī)院檢驗科，河北 保定　071000)

?

利拉魯肽對大鼠壓力負荷型慢性心衰的保護作用

王晨陽1, 曹海濤1*，張志華2，華川3

(1.解放軍第252醫(yī)院動物實驗室，河北 保定071000； 2.解放軍第252醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 保定071000；3.解放軍第252醫(yī)院檢驗科，河北 保定071000)

目的 研究利拉魯肽對壓力負荷型慢性心衰大鼠心臟功能的作用及其機制。方法30只SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、心衰組、利拉魯肽組，每組10只大鼠。心衰組、利拉魯肽組采用腹主動脈縮窄法制備模型，假手術(shù)組只穿線不縮窄。利拉魯肽組術(shù)后12周給予利拉魯肽皮下注射，2 mg/kg·d，共30 d。假手術(shù)組和心衰組給予同等劑量的生理鹽水。給藥30 d后給大鼠稱重，并使用壓力容積系統(tǒng)來檢測血流動力學(xué)指標，同時對大鼠的各個器官稱重。將大鼠麻醉后，腹主動脈抽血離心后取血清，按試劑盒方法測定超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)。結(jié)果心臟稱重顯示，利拉魯肽組的心臟重量明顯低于心衰組(P< 0.05)。壓力容積系統(tǒng)檢測血流動力學(xué)顯示，相比于假手術(shù)組，利拉魯肽組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明顯降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值則明顯增加(P< 0.05)。和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠血清中的SOD值明顯增加(P< 0.05)，BNP值則明顯降低(P< 0.05)。結(jié)論利拉魯肽可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能，減輕心肌細胞的損傷，其機制可能與抗氧化作用相關(guān)。

利拉魯肽；壓力超負荷；心力衰竭

近年來，利拉魯肽作為一種人胰升糖素樣肽1(GLP-1)類似物受到廣泛關(guān)注，由于其良好的降血糖作用，被廣泛的應(yīng)用于2型糖尿病患者。大量研究表明，利拉魯肽不僅具有葡萄糖依賴性降糖作用[1]，同時對心血管系統(tǒng)具有直接或間接的保護作用，并且這種作用獨立于血糖調(diào)節(jié)機制[2]。它具有降低血脂、血壓[3]，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞代謝，預(yù)防動脈粥樣硬化[4]，減少心肌細胞損傷，改善心功能[5]等功效。

大量基礎(chǔ)與臨床研究顯示利拉魯肽對2型糖尿病患者心血管系統(tǒng)具有良好的預(yù)防和改善作用，但是利拉魯肽對于不合并糖尿病的壓力負荷型慢性心衰的作用及機制研究未見報道。壓力負荷型慢性心衰主要是由于壓力負荷產(chǎn)生高血壓，進而導(dǎo)致心臟左室肥厚、重構(gòu)，心臟泵血功能降低，逐步發(fā)生心力衰竭，最終導(dǎo)致心血管病的高死亡率。本研究通過建立壓力負荷型慢性心衰大鼠模型，觀察GLP-1類似物利拉魯肽對慢性心衰大鼠的左心室功能、血清酶的影響，并探討其可能的機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物

SPF級SD雄性大鼠30只，8周，體重160～180 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK(京)2012-0004]。無菌手術(shù)在解放軍第252醫(yī)院動物實驗室[SYXK(軍)2007-019]進行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

利拉魯肽(預(yù)填充注射筆)由諾和諾德(中國)制藥有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)試劑盒均來自R&D公司；日立7600-020全自動生化分析儀(日立公司)； MPVS Ultra-400壓力-容積系統(tǒng)(AD Instrumengts公司)，導(dǎo)管型號為SPR-838，采用PowerLab(AD Instrumengts公司)進行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及給藥

30只大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組10只；心衰組10只；利拉魯肽組10只。心衰組和利拉魯肽組采用腹主動脈縮窄術(shù)制備壓力超負荷心衰大鼠模型。假手術(shù)組只行腹主動脈穿線不縮窄。利拉魯肽組術(shù)后12周給予利拉魯肽皮下注射，2 mg/kg·d。共30 d。假手術(shù)組和心衰組給予同等劑量生理鹽水，共30 d。在手術(shù)過程中，假手術(shù)組死亡1只，心衰組死亡1只，利拉魯肽組死亡1只，在術(shù)后第2周心衰組死亡一只。最后假手術(shù)組9只大鼠，心衰組8只大鼠和利拉魯肽組9只大鼠進入實驗。

1.3.2心衰動物模型的建立

參照Conrad等[6]的方法并作改進[7,8]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。稱重后，用50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后，在左側(cè)脊肋角區(qū)大概2 cm2的范圍備皮，1%碘伏消毒，縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露腹主動脈，剝離腹主動脈周圍的結(jié)締組織，跟據(jù)腹主動脈粗細以直徑為0.8 mm左右的不銹鋼探針(或使用小鼠灌胃針，去掉圓頭)與腹主動脈一起使用4號手術(shù)線結(jié)扎，雙線結(jié)扎，抽出探針形成腹主動脈狹窄(約50%～60%)，縫合肌層和手術(shù)切口，同時腹腔注射青霉素10萬IU。假手術(shù)組腹主動脈只穿線而不進行縮窄，其他手術(shù)步驟同模型組。

1.3.3心、肺/體重比的計算

麻醉后立即開胸取出心臟、肺臟，在預(yù)冷的0～4℃生理鹽水中洗去淤血，濾紙吸干水分，應(yīng)用精密天平測定各組動物的心臟、肺臟的濕重，計算心重比、肺重比。

1.3.4應(yīng)用壓力容積系統(tǒng)對大鼠左心室功能進行測定

開始前大鼠稱重，用0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部備皮消毒，在頸部正中切口，分離氣管后插管，分離右頸總動脈，結(jié)扎頸總動脈遠心端，用動脈夾夾畢頸總動脈近心端后，剪口插入Millar壓力容積導(dǎo)管(SPR-838)，松開動脈夾結(jié)扎頸總動脈近心端，調(diào)整導(dǎo)管位置，緩慢插入左心室。在LabChart_v7.3.7軟件平臺中PVLoop_v2.0軟件記錄穩(wěn)定狀態(tài)下P-V波形的變化；腹部備皮消毒，腹部正中切口，分離下腔靜脈后快速壓閉下腔靜脈(減少回心血量，暫時降低左心室前負荷)，記錄P-V波形的變化；最后自下腔靜脈快速注射10%NaCl溶液100 μL，記錄P-V波形的變化。用肝素處理過的5 mL注射器下腔靜脈取血，將血注入定標套件，取導(dǎo)管容積定標。

1.3.5應(yīng)用labchart軟件分析血流動力學(xué)參數(shù)

在LabChart_v7.3.7軟件中，打開保存的數(shù)據(jù)，選取一段波形穩(wěn)定的P-V環(huán)，對原始數(shù)據(jù)完成校正后，計算出穩(wěn)定狀態(tài)和改變前負荷時的心輸出量(CO)、每搏出量(SV)、收縮末期容積(Ves)、舒張末期容積(Ved)、壓力最大值(Pmax)、收縮末期壓力(Pes)、舒張末期壓力(Ped)、心率(HR)、搏出功(SW)、射血分數(shù)(EF)、左室壓力最大上升速率(dP/dt max)、最大功率(PowMax)、左室壓力最大下降速率(-dP/dt min)、壓力衰退的時間常數(shù)(Tau)等血流動力學(xué)參數(shù)。

1.3.6血漿SOD、BNP和MDA的測定

在麻醉狀態(tài)下，取大鼠下腔靜脈血2 mL，4℃，3000 r/min，離心10 min，分離血漿，-80℃保存，嚴格按照試劑盒說明書添加標本和試劑，用7600-020全自動生化分析儀測定。

1.4統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

2.1體重和器官重量

假手術(shù)組、心衰組和利拉魯肽組大鼠在術(shù)后16周處死，分別稱量體重、心臟和肺臟的重量。發(fā)現(xiàn)和假手術(shù)組相比，心衰組心臟和肺的重量都有增加，其中心臟和心重比有顯著增加(P< 0.01，見表1)，肺臟和肺重比有明顯增加(P< 0.05，見表1)。而利拉魯肽組和心衰組相比，心臟重量明顯減小(P< 0.05)，雖然體重和肺臟重量，以及心重比和肺重比都有所下降，但是并不明顯(P> 0.05，見表1)。

2.2左心室舒縮功能

假手術(shù)組、心衰組和利拉魯肽組大鼠左心室舒縮功能參數(shù)見表2。和假手術(shù)組大鼠比較，心衰組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped、SW、Tau值均有明顯增加(P< 0.05)，而dP/dt max、-dP/dt min、EF、SV和PowMax值則明顯降低(P< 0.05)，心輸出量(CO)雖降低，但并不明顯(P> 0.05)。和假手術(shù)組比較，利拉魯肽組大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明顯降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值則明顯增加(P< 0.05)。

表1　各組大鼠體重和器官重量情況

注：*P< 0.05，**P< 0.01，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表2　各組大鼠左心室功能參數(shù)比較

注：*P< 0.05，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表3　各組大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)的檢測結(jié)果

注：*P< 0.05，與假手術(shù)組比較；#P< 0.05，與心衰組相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

2.3利拉魯肽對壓力負荷型心衰大鼠血清中SOD、BNP、MDA的影響

各組大鼠血清中SOD、BNP、MDA的測定結(jié)果見表3。和假手術(shù)組相比，心衰組大鼠血清中的BNP和MDA明顯增加(P< 0.05)，而SOD值則明顯降低(P< 0.05)。和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠血清中的SOD值明顯增加(P< 0.05)，BNP值則明顯降低(P< 0.05)，MDA值有所下降，但并不明顯。

3　討論

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是由于各種原因?qū)е碌某跏夹募p傷，進而引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，最終導(dǎo)致心室收縮或舒張功能的低下。它是各種心臟病的嚴重階段，具有很高的致殘率及病死率。高血壓造成的心臟壓力負荷是導(dǎo)致心力衰竭的常見病因之一，在血壓過高的情況下，心臟壓力負荷過重，心室肌代償性肥厚以保證射血量。持久的負荷過重，心肌必然發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變而導(dǎo)致失去代償功能。容量超負荷是誘發(fā)心肌肥大和心力衰竭的常見原因之一。

腸促胰素胰升糖素樣肽1(GLP-1)的藥物不僅具有卓越的降糖效果，同時對心血管系統(tǒng)起到了一定的保護作用，利拉魯肽作為GLP-1的代表藥物，通過與遍布全身多種組織的GLP-1受體結(jié)合，發(fā)揮各種作用，尤其是對心血管的作用[9,10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是造成心肌細胞損傷的機制之一，糖尿病心肌病大鼠在經(jīng)過利拉魯肽治療后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物的表達水平明顯降低，心肌細胞的凋亡也明顯減少，并且它對心血管益處是獨立于血糖調(diào)節(jié)機制的[4]。在心肌梗死小鼠模型中，在經(jīng)過7 d的利拉魯肽治療后，心臟破裂發(fā)生率和心臟梗死面積都明顯下降，并且心輸出量增加[11]。但是，利拉魯肽對于壓力負荷型慢性心衰是否起作用，以及其具體機制仍有待進一步研究。

本研究通過對壓力負荷型心衰大鼠給予利拉魯肽治療，和心衰組相比，利拉魯肽組大鼠的心臟重量減少，說明利拉魯肽在一定程度上減緩了心肌重構(gòu)的發(fā)生。LV收縮功能參數(shù)Ves、Pes值在利拉魯肽組有明顯降低，表明利拉魯肽組與心衰組大鼠達到相同Ves時需要比較少的Pes，同樣，LV舒張功能參數(shù)Ved、Ped在利拉魯肽組中降低，說明利拉魯肽組的LV收縮和舒張功能都得到了一定程度的恢復(fù)。此外，利拉魯肽組中反映心室排血功能的參數(shù)EF和PowMax值均明顯增加，進一步說明了利拉魯肽提高了心力衰竭大鼠的LV收縮與舒張功能。上述結(jié)果提示壓力負荷型心衰大鼠在經(jīng)過一段時間的利拉魯肽給藥之后，其LV的收縮與舒張功能都得到明顯改善，甚至心室擴張情況也得到了緩解。

在血流動力學(xué)參數(shù)中，dP/dt max和-dP/dt min是描述心肌收縮和舒張變力性的重要指標，左室壓力最大上升速率dP/dt max增大，心肌收縮功能增強。左室壓力最大下降速率-dP/dt min增大，心肌舒張功能增強[12]。我們的數(shù)據(jù)表明利拉魯肽顯著的增強了心肌收縮和舒張的變力性，心臟損傷明顯減少，心功能得到顯著提升。

氧化應(yīng)激是壓力負荷型心力衰竭的重要機制，SOD是人體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除自由基，其酶活性值的高低反映機體的抗氧化防御水平[13]，在本研究中，心衰組和假手術(shù)組相比，SOD值明顯下降，提示心衰大鼠機體的抗氧化能力明顯不足，而經(jīng)過利拉魯肽治療，SOD值又明顯回升，說明利拉魯肽能夠增強機體的抗氧化能力。

BNP是用來評價心力衰竭程度及預(yù)后狀況的神經(jīng)激素標記物，由心肌細胞分泌，有報道慢性心衰患者血漿BNP濃度比正常人高，而且與心力衰竭的嚴重程度呈正相關(guān)[14]。本研究表明，在大鼠心功能不全時，由于心室超負荷、心肌重構(gòu)、腎素血管緊張素系統(tǒng)激活，BNP值顯著增高，利拉魯肽治療后，隨著心功能的改善BNP值明顯下降。MDA是生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生了脂質(zhì)過氧化性反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其濃度可間接反映細胞和組織功能損傷的嚴重程度。本實驗結(jié)果利拉魯肽組的MDA值低于心衰組，差異并不顯著，提示利拉魯肽并不是主要通過調(diào)節(jié)MDA含量來發(fā)揮抗心衰作用的。

總之，利拉魯肽可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能，減輕心肌細胞的損傷，其機制可能與抗氧化作用相關(guān)，具體機制還有待進一步研究。

[1]Nauck M, Frid A, Herrnansen K,etal. Efficacy and safety comparison of liraglutide, glimepiride, and placebo, all in combination with metformin, in type 2 diabetes：the LEAD (1iraglutide effect and action in diabetes)-2 study [J]. Diabetes Care, 2009, 32(1): 84-90.

[2]Liu J, Liu Y, Chen L,etal. Glucagon-like peptide-1 analog liraglutide protects against diabetic cardiomyopathy by the inhibition of the endoplasmic reticulum stress pathway[J]. J Diabetes Res. 2013, 2013(5): 1-8.

[3]Okerson T, Yan P, Stonehouse A,etal. Effects of exenatide on systolic blood pressure in subjects with type 2 diabetes [J]．Am J Hypertens, 2010, 23(3): 334-339．

[4]Timmers L, Henfiques JP, de Kleijn DP,etal.Exenatide infarct size and improves cardiac function in a porcine model of ischemia and reperfusion injury [J]．J Am Coll Cardiol, 2009, 53(6): 501-510.

[5]Zhao T, Parikh P, Bhashyam S，etal. Direct effects of glucagon-like peptide-l on myocardial contractility and glucose uptake in normal and postischemic isolated rat hearts[J]．J Pharmacol Exp Ther, 2006, 317(3): 1106-1113.

[6]Conrad CH，Brooks WW, Robinson KG,etal. Impaired myocardial function in spontaneously hypertensive rats with heart failure [J]. Am J Physiol, 199l, 260 (1 Pt 2): H136 - 145．

[7]王艷飛，任越，曹雪濱，等.改良慢性壓力超負荷大鼠模型的對比研究[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27(6)：25-27.

[8]王晨陽，孫衛(wèi)衛(wèi)，徐鵬，等.紅景天苷對慢性心力衰竭大鼠腸系膜動脈舒縮作用的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2014，26(11)：11-13.

[9]程向娟，王雄，滕曉煥.利拉魯肽可對抗大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].中華心血管病雜志，2015, 43(3)，259-263.

[10]高妍.利拉魯肽對心血管系統(tǒng)的保護作用[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2013, 29(10): 10b1-10b4.

[11]Noyan-Ashraf MH, Momen MA, Ban K,etal.GLP-1R agonist liraglutide activates cytoprotective pathways and improves outcomes after experimental myocardial infarction in mice[J]. Diabetes, 2009, 58(4): 975-983．

[12]曾山，周欣，涂悅，等.壓力容積導(dǎo)管系統(tǒng)評價卒中易感性自發(fā)性高血壓大鼠左心室功能的意義[J].中華高血壓雜志，2008，16(8)：737-741.

[13]劉穎，譚波宇.烏頭提取物對心衰大鼠抗氧化能力的研究[J].安徽醫(yī)藥，2015, 19(9)：1661-1664.

[14]張勝葉，黃晏，趙乾，等.外源Apelin-13對大鼠阿霉素心力衰竭模型的影響與一氧化碳途徑的關(guān)系[J].中華中老年心腦血管病雜志，2011, 13(5)：452-455.

Liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure

WANG Chen-yang1, CAO Hai-tao1*, ZHANG Zhi-hua2, HUA Chuan3

(1. Department of Animal Experiment, No.252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China;2. Department of Endocrinology, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China;3. Department of Clinical Laboratory, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China)

Objective To explore the effect of liraglutide on pressure-overload chronic heart failure in rats and related mechanisms. Methods Totally 30 SD rats were randomly divided into sham operation group, heart failure group and liraglutide group．The animals were anaesthetized and a Millar pressure volume conductance catheter SPR-838) was inserted through right carotid artery into LV to measure pressure-volume (P-V) loop．Body and organ weight were measured. After the end of intervention, the rats were anesthetized, and abdominal aortic blood taken from the upper serum after centrifugation. Kit method was used to measure superoxide dismutase (SOD), brain natriuretic peptide (BNP), malondialdehyde (MDA)．ResultsCompared with those of the sham operation group, there was a increase in absolute heart weight and (P< 0.05). During the P-V loop analyses, We found that left ventricular (LV) end-systolic volume, end-diastolic volume, end-systolic pressure, end-diastolic pressure and maximum pressure were all remarkablely lower in liraglutide group than HF group in rats (P< 0.05). Peak rate of pressure rise (dP/dt max), peak rate of pressure decline (-dP/dt min), ejection fraction and Maximum Power were increased in liraglutide group comparable by HF group (P< 0.05). SOD activity was significantly increased and BNP concentration was significantly decreased in liraglutide group compared to HF group (P< 0.05). ConclusionsThese results show that liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure possibly through reducing oxidation．

Liraglutide; Pressure-overload; Heart failure

王晨陽(1980-)，女，碩士生，助理研究員，專業(yè)：實驗病理與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: wangbio_2004@163.com。

曹海濤(1979-)，男，主管技師，研究方向：心血管病檢驗與臨床研究。E-mail: cht252@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0064-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.012

2016-03-20