張健　趙煜　盧曉清　吳建

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變應性鼻炎同位素標記相對和絕對定量蛋白質組學研究△

張健趙煜盧曉清吳建

目的研究變應性鼻炎(AR)患者鼻黏膜蛋白質表達譜的變化，從蛋白質水平探討AR的發(fā)病機制。方法采用同位素標記相對和絕對定量技術檢測正常成年人及AR患者中鼻道鼻腔黏膜中的蛋白表達譜，每組4例，篩選差異表達蛋白。結果在AR患者鼻黏膜與正常人鼻黏膜之間篩選出大量差異表達蛋白。上調蛋白60個，主要包括嗜酸性粒細胞溶血磷脂酶(CLC)、普列克底物蛋白同源結構蛋白7(PLEKHA7)等；下調蛋白160個，主要包括腦惡性腫瘤缺失基因(DMBT1)、S100鈣結合蛋白(S100A1)等。結論AR患者鼻黏膜與正常人鼻黏膜蛋白表達差異明顯，其中CLC的上調與 DMBT1的下調可能參與鼻黏膜的炎癥及免疫應答反應。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：309-312)

鼻炎，變應性；蛋白質組學；同位素標記相對和絕對定量

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病和多發(fā)病，主要表現(xiàn)為鼻癢、打噴嚏等，臨床難以根治，多以控制鼻部癥狀為主。截至目前，其確切發(fā)病機制尚不清楚。本研究在前期應用基因芯片研究AR發(fā)病機制的基礎上[1-2]，利用蛋白質組學技術研究正常鼻黏膜組織與AR鼻黏膜組織之間的差異表達蛋白，并分析差異表達蛋白的功能，從蛋白質水平探討AR的發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1實驗材料實驗組：AR患者中鼻道鼻腔黏膜組織；對照組：無鼻部疾病的正常成年人中鼻道鼻腔黏膜組織，每組4例。均為本科住院患者，年齡30～65歲，平均(41.00±3.12)歲；均為男性。取得標本前均得到受試者同意并簽署知情同意書。所有患者無哮喘史及阿司匹林過敏史，皮膚過敏原試驗呈陽性，術前2周未使用抗生素及類固醇激素。AR的診斷依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO) 標準、過敏史及經皮膚過敏原試驗(Lofarma, Milan, Italy)。術中取出標本后，迅速用生理鹽水沖洗，去除血液及碎骨片；再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗，錫箔紙包裹嚴密，置于塑料凍存管內，-80 ℃冰箱保存。

1.2實驗方法

1.2.1樣品裂解和蛋白質定量標本樣品解凍后進行裂解。蛋白質樣品定量采取對其氨基酸序列上的色氨酸進行熒光光譜定量的方法。色氨酸標準品和蛋白質樣品都用緩沖液(8 mol/L尿素+20 mmol/L Tris/HCl, pH=7.6)稀釋，并用熒光分光光度計(Varian, Palo Alto, CA)檢測其中色氨酸的熒光強度，計算出樣品中色氨酸的濃度，除以1.3%后得到樣品中蛋白質的濃度。然后進行1D十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和膠圖銀染，對樣品選取，蛋白質抽提和定量步驟進行實驗質量控制。

1.2.2蛋白質酶解100 μg樣品加入10 ×103超濾管，12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL UA 緩沖液(8 mol/L 尿素， 100 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷， pH=8.5)，12 000×g離心，棄去濾出液。加入終濃度為50 mmol/L 吲哚乙酸(使用UA 緩沖液溶解)，避光室溫反應20 min。12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL UA 緩沖液，12 000×g離心，棄去濾出液。加入200 μL 50 mmol/L 四乙基溴化氨，12 000×g離心，棄去濾出液。重復2遍。加入2 μg 質譜測序級胰酶(Promega, V5113)，37 ℃酶解過夜。12 000×g離心，20 min后收集濾出液，冷凍干燥。 酶解后的肽段再次進行蛋白質定量，對酶解步驟進行實驗質量控制。

1.2.3同位素標記相對和絕對定量和強陽離子肽段分級同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 的8叢試劑放置到室溫，使用50 μL 異丙醇溶解，加入到各個樣品中，室溫300 轉/min振蕩反應2 h；各管加入50 μL 去離子水，室溫300 轉/min振蕩反應30 min終止標記反應。合并各個樣品，充分振蕩混勻后分裝，20 μg/管，真空冷凍干燥保存。1.2.4LC-MS/MS 質譜鑒定色譜柱為實驗室自制的直徑 75 μm、長 15 cm 的 C18 反相毛細管色譜柱。流速為250 nL/min，全程分析時間為240 min/餾分。肽段洗脫梯度為流動相 B(含 0.1%甲酸的乙腈)在 208 min內從 6% 增加至 20%。208～228 min內從20%增加至35%，其后2 min內升至90%并維持至240 min。1.2.5數(shù)據(jù)庫搜索和定量信息提取質譜產生的原始文件使用Proteome Discoverer(1.3版本，Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)進行數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫搜索產生的結果用Proteomics Tool Suite(3.8.0版本)進行譜圖篩選，校正同位素標簽純度，定量數(shù)據(jù)整合。1.2.6篩選標準應用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩兩比較用最小顯著差異(least significant difference, LSD)法。差異蛋白標準是fold<0.83 或 fold>1.2,且P<0.05。

2　結果

2.1蛋白質抽提產物1D SDS-PAGE各個樣品的蛋白質抽提產物SDS-PAGE 總體分布模式在相同的樣品分組中比較類似，蛋白質電泳行為正常，降解現(xiàn)象不明顯，蛋白質定量比較一致，符合后續(xù)實驗研究分析的要求(圖1)。

圖1.　蛋白質抽提產物1D SDS-PAGE　A～H條帶表示每個樣本中總蛋白的凝膠結果

2.2蛋白質組鑒定和定量控制肽段和蛋白質假陽性率<0.01，總共得到14 694條非冗余肽段，對應于2 463個蛋白質組，在8個iTRAQ通道中都存在定量信息。iTRAQ各個通道的蛋白質定量數(shù)值在整體上分布均一，所有通道內蛋白分子量Log2對數(shù)值的上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)基本保持在同一水平(圖2)，未經校正的原始數(shù)據(jù)總體分布的差異小。結果顯示本實驗iTRAQ定量標記實驗具有嚴格質量控制和優(yōu)秀的質譜定量能力。

圖2.　iTRAQ原始定量結果箱線圖分布　橫向1113～1121為各個樣本的iTRAQ穩(wěn)定同位素化學標記通道，縱向為通道內蛋白相對分子質量Log2對數(shù)值

2.3蛋白質定量頻率分布進一步對各個樣品考查蛋白質定量頻率分布(圖3)。各個樣品的分布高度一致，峰值集中在20～23之間，結果顯示本實驗良好的數(shù)據(jù)重復性和定量精確性。

圖3.　蛋白質定量頻率分布　橫坐標為各通道蛋白質相對分子質量的Log2對數(shù)值，縱坐標為相對應的蛋白質密度

2.4實驗處理組兩兩相關性考查原始數(shù)據(jù)各個實驗處理組兩兩相關性(圖4)，數(shù)據(jù)的總體相關性非常優(yōu)秀，R2在0.97～1范圍內分布。結果顯示本實驗iTRAQ定量結果數(shù)據(jù)具有良好的重復性和數(shù)據(jù)可信度。

2.5差異蛋白篩選結果AR患者鼻黏膜及正常人鼻黏膜之間篩選出220個差異表達蛋白。上調蛋白60個，其中上調2倍以上蛋白17個，包括嗜酸性粒細胞溶血磷脂酶 (eosinophil lysophospholipase，CLC)、 普列克底物蛋白同源結構蛋白7(pleckstrin homology domain containing family A member 7 ，PLEKHA7)等；下調蛋白160個，其中下調超過50%以上蛋白65個，主要包括腦惡性腫瘤缺失基因1(deleted in malignant brain tumors 1 protein,DMBT1)、S100鈣結合蛋白(S100A1)等。這些蛋白涉及炎癥反應、免疫應答等多種生理過程。

圖4.　數(shù)據(jù)兩兩相關性　每2個通道之間兩兩比較，得出相似比R2

2.6差異蛋白功能分析選取差異最為明顯的4個蛋白質對數(shù)據(jù)庫進行搜索，并對其應用GO-MF(蛋白組數(shù)據(jù)自動分析系統(tǒng))進行功能分析(表1)。

表1　AR鼻黏膜差異蛋白質GO-MF功能分析

3　討論

AR的發(fā)病機制尚不完全清楚。我們課題組前期應用基因芯片研究變態(tài)反應的發(fā)病機制，結果提示炎癥介質和細胞因子對AR的發(fā)生可能起很重要的作用[1-2]。本實驗在此基礎上利用蛋白質組學的方法，檢測了AR患者中鼻道鼻腔黏膜與正常成年人中鼻道鼻腔黏膜蛋白表達譜，研究結果發(fā)現(xiàn)了大量差異表達蛋白。其中差異最為明顯的有CLC、PLEKHA7、S100A1和DMBT1。

3.1CLCCLC廣泛存在于原核細胞和真核細胞中，被認為與磷脂代謝密切相關，在嗜酸性粒細胞內蛋白中占有很大比例[3-4]。顆粒內超微結構分析表明，CLC主要與炎癥反應有關[5]，其主要生物學功能是將溶血卵磷脂水解成為甘油磷脂酰膽堿及少量游離脂肪酸。溶血磷脂是細胞骨架的重要組成部分，因此CLC在維持細胞骨架穩(wěn)定性方面具有重要作用，而AR的病理學特點正是嗜酸性粒細胞的浸潤。本實驗結果顯示,CLC有大幅度上調，上調2倍以上，這與Ghafouri等[6]對AR患者鼻腔沖洗液進行的蛋白質組學研究結果相符合。同時，Bryborn等[7]也據(jù)此進行了基因驗證，推測CLC的遺傳變異與AR相關。我們的研究結果認為，可能的原因是CLC引起鼻黏膜細胞骨架破壞，導致鼻黏膜細胞壞死或者凋亡，釋放一系列細胞因子，觸發(fā)或者進一步加重了鼻腔黏膜局部的變態(tài)反應，導致AR的發(fā)生。

3.2PLEKHA7PLEKHA7是一種附著鏈接蛋白，對維持黏膜上皮細胞穩(wěn)定性具有重要作用。PLEKHA7為黏附小帶的生發(fā)和形態(tài)、功能維持所必需，主要與閉角型青光眼有關[8]。目前關于PLEKHA7與AR之間的關系尚未見報道。本實驗結果顯示，AR患者中鼻道鼻腔黏膜與正常成年人中鼻道鼻腔黏膜蛋白表達明顯上調，推測其在AR鼻黏膜中高表達，可能破壞了鼻黏膜上皮的穩(wěn)定性，引起局部鼻黏膜損傷，從而導致AR發(fā)作。

3.3S100A1S100A1為S100大家族中的一員，屬于鈣結合蛋白，具備細胞內和細胞外調節(jié)活性，參與多種細胞活動，其主要生物學功能是調節(jié)細胞內外的鈣離子濃度，進而影響蛋白磷酸化，最終可以實現(xiàn)對細胞膜上離子通道及電生理過程的調控。王鑫等[9]在研究伴有AR的鼻息肉免疫相關基因表達譜時發(fā)現(xiàn)，實驗組織較正常組織相比，S100A2表達下調。本實驗中S100A1顯著下調，與本課題組前期的基因芯片研究結果及王鑫等[9]的結果接近，提示S100A1與AR有密切聯(lián)系，可能是調節(jié)鼻黏膜細胞內外鈣離子濃度，導致AR發(fā)生，具體機制有待進一步研究。3.4與前期基因芯片研究結果對比我們將本次蛋白質組學的研究結果與本課題組前期的基因芯片研究結果對比[1-2]?；蛐酒芯拷Y果顯示：DMBT1表達明顯下調；本蛋白質組學研究中，DMBT1表達亦明顯下調。

DMBT1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因。Kang等[10]認為，DMBT1與上皮發(fā)育有密切關系，DMBT1能將上皮重建的調節(jié)與炎癥反應聯(lián)系起來，在維持黏膜上皮局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用。Reichhardt等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DMBT1在新生兒糞便及羊水中含量較高，尤其是在胎糞中更是占到所有蛋白總量的4%～10%，最終認為DMBT1在新生兒的先天性免疫機制中有重要作用。同時，Ronellenfitsch等[12]也發(fā)現(xiàn)，如果新生兒出生時伴有感染性疾病，母乳中的DMBT1含量也會顯著提高，因此，DMBT1在母乳中可能與免疫球蛋白類似參與了先天性免疫防御。腸炎癥性疾病時，腸上皮細胞內的白細胞介素27誘導的DMBT1表達上調。Diegelmann等[13]證實，DMBT1在抗炎、抗菌過程中有重要作用。本次實驗中DMBT1表達明顯下調，這與國內外有關報道一致[14-15]，并與本課題組前期的基因芯片研究結果相吻合。我們認為，DMBT1的下調可能破壞了鼻腔黏膜局部微環(huán)境的穩(wěn)定，鼻腔黏膜免疫應答出現(xiàn)了問題，降低了黏膜的抗感染能力，最終導致AR的發(fā)生。

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(本文編輯楊美琴)

Isobaric tags for relative and absolute quantitation proteomic research of allergic rhinitis

ZHANGJian,ZHAOYu,LUXiao-qing,WUJian.

DepartmentofOtorhinolaryngology,ShanghaiChangzhengHospital,Shanghai200003,China

WU Jian, Email: jianwu2008@126.com

ObjectiveTo study the protein expression profiles of allergic rhinitis (AR) and to explore the pathogenic mechanisms of AR from the level of proteins. MethodsFour samples of AR mucosa and 4 samples of normal nasal mucosa were collected and the protein expression profiles of the samples were detected by means of isobaric tags for relative and absolute quantitation technique. The differentially expressed proteins were analyzed and discussed. ResultsThere were totally 220 differentially expressed proteins. Among them, 60 proteins including eosinophil lysophospholipase (CLC), pleckstrin homology domain containing family A member 7 (PLEKHA7), etc. were up-regulated and 160 proteins including detected in malignant brain tumors 1 protein (DMBT1), S100A1, etc. were down-regulated. ConclusionsThere were differences in protein expression profiles between AR and normal nasal mucosa. Differentially expressed proteins provide new cues for the study of pathogenesis of AR. Up-regulation of CLC and down-regulation of DMBT1 may be involved in inflammation, immune response of nasal mucosa. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:309-312)

Rhinitis, allergic; Proteomics; Isobaric tags for relative and absolute quantitation

上海市科委西醫(yī)引導重點科研項目(14411960400，14411960401)；上海市科委產學研項目(14DZ1940103)

上海長征醫(yī)院耳鼻咽喉科上海200003

吳建(Email: jianwu2008@126.com)

張健和趙煜為共同第一作者

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.002

2015-11-11)