劉　玉，司玉潔，趙宇梅，王　寧

（國(guó)家海洋技術(shù)中心，天津　300112）

溫度控制對(duì)分光光度法測(cè)定pH的影響

劉玉，司玉潔，趙宇梅，王寧

（國(guó)家海洋技術(shù)中心，天津300112）

海洋中二氧化碳含量增加，使得海洋生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化。海洋碳循環(huán)及海洋酸化的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)是評(píng)估生態(tài)環(huán)境變化的重要指標(biāo)，pH作為一項(xiàng)碳循環(huán)監(jiān)測(cè)重要指標(biāo)，其測(cè)量的精度指標(biāo)要求達(dá)到千分之五，傳統(tǒng)意義上的敏感電極法測(cè)量海水中pH測(cè)量精度為±0.2，已不能滿(mǎn)足海水碳循環(huán)監(jiān)測(cè)的要求，分光光度法測(cè)定海水pH無(wú)需校正，精密度±0.005，該方法可用于碳循環(huán)船基監(jiān)測(cè)和岸基監(jiān)測(cè)。分光光度法測(cè)定海水pH，測(cè)量環(huán)境和樣品恒溫于25℃，一般商用分光光度計(jì)無(wú)恒溫功能，本研究通過(guò)恒溫水循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)分光光度計(jì)艙內(nèi)側(cè)壁及比色皿架外壁進(jìn)行恒溫設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確控制溫度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃下，pH隨溫度呈線(xiàn)性變化、5組實(shí)測(cè)pH值與公式計(jì)算理論值差值無(wú)顯著差異。在25.0℃測(cè)定5個(gè)不同海水樣本pH，均得到了穩(wěn)定數(shù)值。

溫度控制；分光光度法；pH測(cè)定

pH是海洋碳循環(huán)體系的重要參數(shù)之一，在海洋監(jiān)測(cè)中具有重要意義。對(duì)pH進(jìn)行長(zhǎng)期連續(xù)高精度監(jiān)測(cè)，可以為海洋碳循環(huán)和海洋酸化的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。目前，測(cè)量海水pH的主要方法有電極電位法和分光光度法。電極電位法發(fā)展較早，現(xiàn)已應(yīng)用到海水pH的常規(guī)現(xiàn)場(chǎng)原位測(cè)量中，但該方法受電極漂移和校準(zhǔn)技術(shù)等影響，測(cè)量精度相對(duì)較低，在長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)中受到了一定限制。分光光度法測(cè)量海水中pH值從20世紀(jì)80年代末開(kāi)始發(fā)展，該方法準(zhǔn)確度與精密度較高，并且無(wú)需校正，已在國(guó)外得到廣泛應(yīng)用［1］。

分光光度法測(cè)量pH是由分光光度計(jì)測(cè)量樣品加入顯色劑前后變化情況來(lái)判定樣品中所含［H+］，由此得到所測(cè)樣品的pH值。

分光光度法pH測(cè)定的二級(jí)解離過(guò)程如式（1）所示：

式中：“I”代表顯色劑，在海水樣品中的含量很低。樣品的總氫離子濃度由式（2）所示：

該方法的原理是基于不同形式的顯色劑具有不同的吸收光譜。因此，組合光譜里的信息可以用來(lái)估算［I2-］/［HI-］。

朗伯－比爾定律給出了單個(gè)波長(zhǎng)，λ的吸光值，光程為1。

式中：βλ與樣品的背景吸收有關(guān)；e是由于儀器噪音所造成的誤差項(xiàng)。消光系數(shù)的值：ελ（HI-）及ελ（HI2-）作為波長(zhǎng)的函數(shù)已測(cè)量，那么，雙波長(zhǎng)以及多波長(zhǎng)吸光率的測(cè)量可用來(lái)估算［I2-］/［HI-］的比值。

在僅有雙波長(zhǎng)的情況下，假設(shè)背景可以通過(guò)一個(gè)負(fù)的程序得以消除，式（3）可以經(jīng)重新整理得到（假設(shè)不存在實(shí)驗(yàn)誤差）：

式中：1、2分別為不同的波長(zhǎng)；ε為特定物質(zhì)在波長(zhǎng)1和2處各自的消光系數(shù)。

采用間甲酚紫作為顯色劑的分光光度法測(cè)定海水的pH范圍是7.90～8.40?？赏瓿蓮谋韺又辽顚雍Ｋ畃H測(cè)定，精密度達(dá)0.000 4 pH，該方法在國(guó)外20世紀(jì)90年代早期已得到廣泛的應(yīng)用。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員也在不斷的完善此測(cè)量方法，使得pH測(cè)量達(dá)到碳循環(huán)等緩慢生態(tài)環(huán)境變化對(duì)其高精度的要求。Wensheng Yao研究發(fā)現(xiàn)指示劑如間甲酚紫不純對(duì)測(cè)定海水pH有一定影響［2］。Xuewu Liu等利用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)間甲酚紫指示劑進(jìn)行純化［3］，使用純化后的間甲酚紫用分光光度法測(cè)定海水pH以提高測(cè)量精度。Mark C等利用快速色譜法對(duì)間甲酚紫和甲酚紅進(jìn)行更有效的純化，從而提高分光光度法測(cè)定海水pH的精度［4-5］。

在Guide to best practices for oceanC O2me asurement一書(shū)中規(guī)定的分光光度法測(cè)定海水pH過(guò)程中，測(cè)量環(huán)境和樣品恒溫于25℃，一般商用分光光度計(jì)無(wú)恒溫功能，因此操作過(guò)程中溫度的控制成為制約該方法推廣應(yīng)用的關(guān)鍵［1］。從式（6）中可知溫度變化對(duì)海水pH影響較大，指導(dǎo)手冊(cè)提出了在恒溫條件下完成分光光度測(cè)量海水pH，但商用分光光度計(jì)未設(shè)置恒溫裝置，分光光度計(jì)就溫度控制方面也未進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì)，導(dǎo)致機(jī)器內(nèi)部溫度難對(duì)待測(cè)液體影響較大，控制溫度已成為分光光度法準(zhǔn)確測(cè)定pH的主要問(wèn)題。目前控溫措施，多采用恒溫水浴及空調(diào)控制室內(nèi)溫度來(lái)達(dá)到待測(cè)液溫度控制，而儀器內(nèi)部溫度變化所及室內(nèi)人員流動(dòng)帶來(lái)的室內(nèi)溫度變化，導(dǎo)致了溫度控制效果欠佳。孫墨杰［6］利用半導(dǎo)體制冷片來(lái)控制pH測(cè)定溫度，有效地提高了pH計(jì)的測(cè)量精確度。廈門(mén)大學(xué)李權(quán)龍等采用將自行研制的小型分光光度計(jì)測(cè)量單元全部至于恒溫箱中，實(shí)現(xiàn)恒溫測(cè)量。

本研究是在分光光度計(jì)中增加控溫系統(tǒng)，通過(guò)將光度計(jì)艙內(nèi)搭建水冷裝置控制分光光度計(jì)艙內(nèi)溫度，水浴功能對(duì)待測(cè)水樣進(jìn)行預(yù)熱，在恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)室中，準(zhǔn)確控制pH測(cè)定的環(huán)境溫度，提高該方法準(zhǔn)確度，保障該方法測(cè)定pH可以在實(shí)驗(yàn)室中有效運(yùn)行，為高精度海水pH測(cè)定提供可靠數(shù)據(jù)，為海水酸化等長(zhǎng)期海水pH監(jiān)測(cè)項(xiàng)目提供保障技術(shù)。

1　恒溫測(cè)定海水樣品pH

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備與實(shí)驗(yàn)試劑

設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（GBC Cintra2020）；可控溫恒溫水?。浑娮臃治鎏炱剑诽乩?托利多XS205DU）；水銀溫度計(jì)（精度0.1℃）。

試劑：間甲酚紫（分子量382.43）；海水pH緩沖溶液（成分：MgCl2·6H2O，CaCl2，NaCl，KCl，Na2SO4，MgCl2，HCl，TRIS等試劑，依據(jù)Guide to best practices for ocean CO2measurement自行配制）；東印度洋、三亞、寧波、青島、塘沽等不同海域的海水作為待測(cè)樣品。超純水，由普希（GWA-UN2）制造。

1.2數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析前，采用Levene’S法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)不滿(mǎn)足齊性方差時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或平方根處理。采用單因子方差分析（One way ANOVA）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，用Tukey法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟

設(shè)定恒溫系統(tǒng)至實(shí)驗(yàn)溫度，將待測(cè)樣品加入比色皿并于恒溫系統(tǒng)水浴槽中預(yù)熱，每個(gè)恒溫點(diǎn)控溫10 min，分別在434 nm，578 nm和730 nm測(cè)定海水pH緩沖溶液的吸光值；然后將樣品倒入試管并加入2 mmol/L間甲酚紫0.05～0.1 mL攪拌均勻，分別測(cè)定緩沖溶液加入間甲酚紫顯色后434 nm，578 nm，730 nm 3個(gè)波長(zhǎng)下的吸光值。在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5個(gè)溫度梯度點(diǎn)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。在恒溫25℃條件下，對(duì)東印度洋、三亞、寧波、青島、塘沽等5個(gè)不同海域的海水進(jìn)行pH測(cè)定。

分別控制溫度在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃測(cè)定自行配置的海水pH緩沖溶液的pH值，與其理論值進(jìn)行對(duì)比，研究同一溶液在不同溫度下對(duì)其pH測(cè)量的影響；恒溫25℃下，測(cè)定該緩沖溶液pH穩(wěn)定性并與同條件下未控溫該緩沖溶液pH穩(wěn)定性進(jìn)行對(duì)比；測(cè)定不同溫度對(duì)pH的影響，設(shè)定25℃及臨近的4個(gè)溫度（24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃）對(duì)測(cè)定海水pH緩沖溶液的pH值與對(duì)應(yīng)溫度的理論值進(jìn)行對(duì)比；恒溫25℃，測(cè)定東印度洋、三亞、寧波、青島、塘沽等不同海域的海水pH。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)置5個(gè)平行樣進(jìn)行分析。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，分析通過(guò)增加溫度控制裝置前后變化對(duì)分光光度計(jì)測(cè)量的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1不同溫度下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液pH測(cè)定

在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5個(gè)溫度梯度點(diǎn)，觀察海水pH緩沖溶液在不同溫度下的線(xiàn)性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1顯示，該緩沖溶液pH值隨溫度升高而降低，由8.087 8（24.0℃）降至8.02（26.0℃），在該區(qū)間內(nèi)pH與溫度呈線(xiàn)性關(guān)系該結(jié)果同式（6）理論值法計(jì)算相關(guān)性為R=0.994 5。有效控制了實(shí)驗(yàn)溫度，為實(shí)驗(yàn)提供了良好的恒溫條件，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度。

圖1　不同溫度下pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液pH值

2.2控溫與未控溫條件下pH測(cè)定

利用海水pH緩沖溶液進(jìn)行了控溫與未控溫條件下的測(cè)定。將比色皿放入艙內(nèi)連續(xù)進(jìn)行5次測(cè)定，結(jié)果如圖2所示是控溫后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化范圍較?。?.051～8.053），而未進(jìn)行控溫實(shí)驗(yàn)組則pH值降低了0.022（8.054降至8.032）。通過(guò)控溫裝置對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行控溫，提高了測(cè)量的重現(xiàn)性。

圖2　控溫對(duì)pH測(cè)定的影響

2.3不同溫度下pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液實(shí)測(cè)值與計(jì)算值偏差

分光光度法測(cè)定pH值是通過(guò)測(cè)定吸光度變化計(jì)算而來(lái)，在一定溫度下可以通過(guò)設(shè)置溫度系數(shù)得到理論值，測(cè)定值與理論值存在偏差，圖3為該差值在24.0℃～26.0℃之間的5個(gè)溫度無(wú)顯著差異（p＞0.05）。pH理論值通過(guò)式（6）計(jì)算所得，如表1所示。

圖3　不同溫度測(cè)量值與推導(dǎo)致差值

表1　通過(guò)公式計(jì)算pH理論值

2.4分光光度法測(cè)量結(jié)果

采用分光光度法分別對(duì)東印度洋、三亞、寧波、青島、天津5個(gè)水樣在25.0℃進(jìn)行測(cè)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。在不同地區(qū)水樣測(cè)試中，均能表現(xiàn)出較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定。

表2　分光光度法測(cè)量結(jié)果

3　結(jié)論

目前使用分光光度法測(cè)定pH方法均通過(guò)樣品水浴及實(shí)驗(yàn)室恒溫來(lái)達(dá)到最大程度的控制溫度在25℃，但分光光度計(jì)測(cè)量量過(guò)程中儀器自身發(fā)熱對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響難以控制。本項(xiàng)研究是通過(guò)加入儀器內(nèi)部水循環(huán)控制來(lái)進(jìn)行控溫，提高了測(cè)量過(guò)程中溫度控制的穩(wěn)定性，保證了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠。并且通過(guò)在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5個(gè)溫度下進(jìn)行的多組實(shí)驗(yàn)，控溫系統(tǒng)的搭建改善了溫度對(duì)pH測(cè)定的影響，減少分光光度計(jì)測(cè)量海水pH過(guò)程中實(shí)際操作帶來(lái)的測(cè)量誤差，提高了測(cè)量精密度。

［1］Dickson A G，Sabine C L，Christian J R.Guide to Best Practices for Ocean CO2Measurements［M］.North Pacific Marine Science Organization，2007.

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［6］孫墨杰，陳長(zhǎng)安.在線(xiàn)恒溫pH計(jì)的研究［J］.東北電力學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（2）:24-27.

Study on the Effect of Temperature Control on pH Measurement by the Spectrophotometric Method

LIU Yu，SI Yu-jie，ZHAO Yu-mei，WANG Ning
National Ocean Technology Center，Tianjin 300111，China

The increasing content of carbon oxide in seas and oceans has led to changes in marine ecological environment.The monitoring data of marine carbon cycle and ocean acidification are significant indicators used to evaluate the change of ecological environment in seas and oceans.As an important indicator，pH is to survey the carbon cycle，with its measuring accuracy being demanded to reach 5‰.So far，the accuracy of marine pH measured by the traditional sensitive electrode measurement method is±0.2，not able to meet the requirement of seawater carbon cycle monitoring.However，the accuracy of the spectrophotometric method is±0.005 and it needs not to be calibrated to measure marine pH.So the spectrophotometric method has been used in ship and shorebased monitoring on carbon cycle.In the Guide to best practices for ocean CO2measurement，the temperature of the environment and samples to be measured is stipulated to be kept at 25℃when the spectrophotometric method is adopted to measure the pH of seawater.However，the temperature can not be controlled using ordinary commercial spectrophotometers.Therefore，temperature control becomes the key factor restricting the development and application of the spectrophotometric method.In this study，the constant temperature system of water cycle is applied to design the chamber wall of the spectrophotometer and the outer wall of the cuvette holder to control the temperature.The results show that pH has linear change with changing temperature when the standard buffer solution is at the temperature of 24.0，24.5，25.0，25.5 and 26.0℃.No significant difference is observed between the pH values of the five groups and the theoretical values calculated from the formula.Besides，the pH values of different seawater samples measured at 25.0℃are all stable.

temperature control；spectrophotometric method；pH measurement

X834

A

1003-2029（2016）03-0094-04

10.3969/j.issn.1003-2029.2016.03.018

2015-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41206083）；天津科技興海項(xiàng)目資助（KJXH2013-21）

劉玉（1987-），男，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)。E-mail：liuyu18@foxmail.com