嚴(yán)曉陽, 鄭紹成, 應(yīng)禮彪

(1. 浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華　321004； 2. 金華市環(huán)境科學(xué)研究院，浙江 金華　321017)

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伊馬替尼衍生物的合成及其抗腫瘤活性

嚴(yán)曉陽1, 鄭紹成1, 應(yīng)禮彪2*

(1. 浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華321004； 2. 金華市環(huán)境科學(xué)研究院，浙江 金華321017)

以4-硝基-2-氨基甲苯為起始原料，經(jīng)加成、縮合、環(huán)化和還原反應(yīng)制得中間體N-(2-甲基-5-氨基苯基)-4-(3-吡啶基)嘧啶-2-胺(4)，再與取代酰氯反應(yīng)，合成了7個(gè)新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR-MS 表征。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法考察了5對人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、子宮頸癌細(xì)胞(Hela)、肺癌細(xì)胞(H460)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)體外抑制活性。結(jié)果顯示：5e體外抑制活性最優(yōu)，其IC50分別為10.90±1.00 μmol·L-1； 8.51±0.90 μmol·L-1； 13.15±1.11 μmol·L-1； 14.75±0.78 μmol·L-1。

4-硝基-2-氨基甲苯; 伊馬替尼衍生物; 合成; 四甲基偶氮唑鹽; 抗腫瘤活性

惡性腫瘤，又稱癌癥，是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病。2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《世界癌癥報(bào)告》在2008年世界范圍內(nèi)有1200萬人被確診患有癌癥，其中還有760萬人因癌癥而死亡，而這死亡人數(shù)卻占到了全球死亡人數(shù)的13%，癌癥的死亡人數(shù)預(yù)計(jì)全球范圍內(nèi)還會繼續(xù)增加，癌癥如果不加以干預(yù)，到2030年將有1200萬人因癌癥而死亡，在低收入或中等收入的國家死亡人數(shù)占70%[1-3]。設(shè)計(jì)合成高效的抗腫瘤藥物和改造已有化學(xué)藥物是目前化學(xué)藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

Scheme 1

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesilate)，化學(xué)名為4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-{[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基}苯基-苯胺甲磺酸鹽，由瑞士諾華(Novartis) 公司開發(fā)，于2001 年獲得美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[4-5]。伊馬替尼可靶向3種酪氨酸激酶受體:C-kit(原癌基因蛋白)、BCR-ABL(癌基因產(chǎn)物)和PDGF(血小板衍生生長因子)受體[6-7]，因此也廣泛應(yīng)用于其他受體有關(guān)的腫瘤疾病的治療。目前甲磺酸伊馬替尼在治療慢性髓細(xì)胞白血病上取得了顯著的療效，但是隨著臨床上的應(yīng)用，其耐藥性和不良反應(yīng)(如惡心、嘔吐、水腫、皮疹、骨關(guān)節(jié)及肌肉疼痛、中性粒細(xì)胞及血小板減少等)[8-10]相繼出現(xiàn)。因此設(shè)計(jì)合成伊馬替尼衍生物并考察其生物活性具有重要意義[11]。

本文參考文獻(xiàn)[12-13]方法，以2-甲基-5-硝基苯胺(1)為起始原料,經(jīng)加成、縮合、環(huán)化和還原反應(yīng)得重要中間體伊馬替胺(4)，再與取代酰氯反應(yīng)合成了7個(gè)新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)(Scheme 1)。并對5進(jìn)行人肝癌細(xì)(HepG2)[13]、子宮頸癌細(xì)胞(Hela)、肺癌細(xì)胞(H460)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)體外抑制活性測試。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

RY-2型熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；Varian-Mercury 600型超導(dǎo)核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo))；Thermo Scientific Q Exactive型高分辨質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 2-甲基-5-硝基苯胍(2) 的合成

在干燥的反應(yīng)瓶中依次加入1 40.0 g(0.26 mol)、單腈胺22.0 g(0.55 mol)和乙醇150 mL，攪拌下滴加濃鹽酸29 mL，滴畢，回流反應(yīng)15 h。反應(yīng)液減壓除溶后加入水，于-5～0 ℃滴加硝酸銨的水溶液150 mL(30%)，滴畢，保溫反應(yīng)1～2 h。過濾，濾餅用乙醚洗滌，干燥得白色固體2 55 g, m.p.222～224 ℃。

(2)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-胺(3)的合成

將2 45.0 g ( 0.18 mol )和3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮30.7 g( 0.18 mol)溶于異丙醇(200 mL)中，攪拌下加入NaOH 7.7 g(0.20 mol)，回流反應(yīng)12 h。冷卻至室溫(析出固體)，抽濾，濾餅依次用異丙醇(200 mL)和水(100 mL)洗滌，甲醇重結(jié)晶得黃色固體3 46.0 g，收率87%，m.p.195～198 ℃[14]。

(3) 4的合成

在三口瓶中依次加入3 3.3 g(0.01 mol)， DMF 5 mL， 甲醇100 mL和鈀碳0.3 g，通氫氣，于室溫反應(yīng)至終點(diǎn)。抽濾，濾液蒸干甲醇得粗品，用二氯甲烷重結(jié)晶得黃色固體4 2.66 g。收率96%；1H NMRδ: 9.24(d,J=1.83 Hz, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.68(s, 1H), 8.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.41(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.54(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.36(d,J=5.14 Hz, 1H), 6.87(d,J=8.07 Hz, 1H), 6.79(d,J=2.20 Hz, 1H), 6.34(dd,J=2.20 Hz, 8.07 Hz, 1H), 4.85(s, 2H), 2.06(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 161.9, 161.7, 159.8, 151.8, 148.5, 147.2, 138.4, 134.8, 132.8, 130.8, 124.3, 119.8, 111.6, 111.4, 107.5, 17.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H16N5{[M+H]+}278.140 0, found 278.140 0。

(4) 5a～5g的合成通法

在反應(yīng)瓶中加入4 0.276 g (1 mmol)和二氯甲烷10 mL，攪拌下于室溫加入取代酰氯 1 mmol和三乙胺 1 mmol。反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC 跟蹤)(展開劑: A=V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2)。反應(yīng)液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1/10)純化得5a～5g。

5a: 白色固體，收率82%；1H NMRδ: 10.22(s, 1H), 9.36～9.20(m, 1H), 8.98(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.51(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.10(d,J=1.83 Hz, 1H), 7.99～7.92(m, 2H), 7.60～7.57(m, 1H), 7.54(s, 1H), 7.54～7.52(m, 1H), 7.52～7.51(m, 1H), 7.49(dd,J=2.11 Hz, 8.16 Hz, 1H), 7.43(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.9, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.3, 137.6, 135.5, 134.9, 132.7, 131.9, 130.5, 128.8, 128.1, 128.1, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5O{[M+H]+}382.166 2, found 382.166 0。

5b: 白色固體，收率81.%;1H NMRδ: 10.11(s, 1H), 9.32(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.01(s, 1H), 8.72(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.55(d,J=5.14 Hz, 1H), 8.52(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.12(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.02～7.97(m, 2H), 7.58～7.54(m, 1H), 7.52(dd,J=2.20 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.24(d,J=8.44 Hz, 1H), 7.13～7.05(m, 2H), 3.87(s, 3H), 2.27(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 162.3, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 130.0, 127.9, 127.5, 124.3, 117.7, 117.2, 114.0, 108.0, 55.9, 18.1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O2{[M+H]+}412.176 8, found 412.176 6。

5c: 白色固體，收率78.9%；1H NMRδ: 9.79(s, 1H), 9.26(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.92(s, 1H), 8.69(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.46(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.90(d,J=1.47 Hz, 1H), 7.55～7.47(m, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.28(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.13(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.28(t,J=7.43 Hz, 2H), 2.19(s, 3H), 1.58(t,J=7.15 Hz, 2H), 1.38～1.19(m, 8H), 0.85(t,J=6.97 Hz, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 171.5, 162.0, 161.6, 159.9, 151.8, 148.7, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 127.2, 124.2, 116.4, 115.9, 108.0, 40.5, 36.9, 31.6, 29.1, 29.0, 25.7, 22.5, 18.0, 14.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H30N5O{[M+H]+}404.244 5, found 404.244 4。

5d: 白色固體，收率85.6 %；1H NMRδ: 10.13(s, 1H), 9.30(d,J=1.65 Hz, 1H), 9.00(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.57～8.43(m, 2H), 8.10(d,J=1.28 Hz, 1H), 7.88(d,J=8.25 Hz, 2H), 7.55(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.49(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.33(d,J=8.07 Hz, 2H), 7.21(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.39(s, 3H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 129.0, 128.5, 125.3, 117.7, 117.2, 108.0, 19.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O{[M+H]+}396.181 9, found 396.181 9。

5e: 白色固體，收率80.6%；1H NMRδ: 10.48(s, 1H), 9.35(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.10(s, 1H), 8.80(dd,J=1.28 Hz, 4.95 Hz, 1H), 8.72(d,J=8.07 Hz, 1H), 8.57(d,J=4.95 Hz, 1H), 8.09(s, 1H), 7.72(dd,J=5.04 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.59(dd,J=1.56 Hz, 7.43 Hz, 1H), 7.57(d,J=8.07 Hz, 1H), 7.51～7.49(m, 2H), 7.48～7.45(m, 1H), 7.40(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 161.4, 161.1, 160.1, 149.4, 146.4, 138.2, 137.6, 137.6, 137.4, 133.7, 131.5, 130.7, 130.4, 130.1, 129.4, 128.2, 127.7, 125.3, 116.8, 116.5, 108.2, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H19N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5f: 白色固體，收率82.5%；1H NMRδ: 10.28(s, 1H), 9.28(d,J=2.20 Hz, 1H), 8.99(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.52(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.97 Hz, 7.98 Hz, 1H), 8.09(d,J=1.65 Hz, 1H), 7.99(d,J=8.62 Hz, 2H), 7.64～7.59(m, 2H), 7.52(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.48(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 128.9, 128.3, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5g: 白色固體，收率80.6%；1H NMRδ: 9.93(s, 1H), 9.26(d,J=2.02 Hz, 1H), 8.91(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.47(td,J=1.77 Hz, 8.02 Hz, 1H), 7.90(s, 1H), 7.53(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.27(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.14(d,J=8.25 Hz, 1H), 3.59(s, 3H), 2.61(s, 4H), 2.19(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ： 173.4, 170.0, 162.1, 161.6, 159.9, 151.8, 148.6, 138.3, 137.7, 134.9, 132.7, 130.6, 127.2, 124.3, 116.2, 115.7, 108.0, 51.8, 31.3, 29.0, 18.0; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H22N5O3{[M+H]+}392.171 7, found 392.171 8。

1.3抗腫瘤細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法[15]測定了5a～5g對HepG2， Hela， H460和MCF-7四種腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤活性[16]。

(1) 待測樣制備

將狀態(tài)良好的貼壁細(xì)胞(HepG2， Hela， H460， MCF-7)胰酶消化重懸計(jì)數(shù)，接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)目約104個(gè)，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后每孔中加入含不同濃度化合物的無血清培養(yǎng)基(每個(gè)濃度設(shè)四個(gè)復(fù)孔，以不加細(xì)胞的孔讀數(shù)時(shí)作空白，加細(xì)胞不加化合物的孔作對照孔，作實(shí)驗(yàn)陽性對照)。

(2) 測定方法

將新配的5a～5g的二甲亞砜溶液加入孔中，終濃度分別為5 μmol·L-1，10 μmol·L-1， 20 μmol·L-1， 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1。靜置48 h，每孔加入5 mg·ml-1MTT 10 uL ,繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 uL，酶標(biāo)儀上于490 nm處測定吸光度值，通過比較對照孔和化合物孔的讀數(shù)，分別計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。{抑制率=[(陰性對照組OD值-受試物組OD值) /陰性對照組OD值]×100%}，計(jì)算不同濃度下的抑制率，再以此求出各樣品的IC50值。

2　結(jié)果與討論

2.1合成

合成3時(shí)，我們采用了異丙醇做反應(yīng)的溶劑，提高了反應(yīng)溫度，縮短了反應(yīng)時(shí)間。

合成4時(shí)，采用鈀碳做催化劑還原硝基，比傳統(tǒng)的鐵粉還原后處理簡單，副產(chǎn)物少，可以直接用于下一步反應(yīng)。

2.2抗腫瘤活性

表1為5的抗腫瘤活性。由表1可見，5對HepG2， Hela， H460和MCF-7 四種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。其中5e的細(xì)胞毒抑制活性最大。其IC50分別為10.90 μmol·L-1， 8.51 μmol·L-1， 13.15 μmol·L-1和14.75 μmol·L-1。

表1　5a～5g的體外抗腫瘤抑制活性

3　結(jié)論

合成了7個(gè)新型伊馬替尼衍生物(5a～5g)，采用MTT法研究了5對HepG2， Hela， H460和MCF-7四種腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明：2-氯-N-{4-甲基-3-[4-(吡啶-3-基)吡啶-2-基氨基]苯基}苯甲酰胺(5e)的細(xì)胞毒抑制活性最大。發(fā)現(xiàn)芳環(huán)上帶吸電子基團(tuán)氯取代的芳香類伊馬替尼衍生物的抑制活性較高。為今后研究該類化合物結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系提供了一定的依據(jù)，進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與生物活性研究正在進(jìn)行中。

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Synthesis and Antitumor Activities of Imatinib Derivatives

YAN Xiao-yang1,ZHENG Shao-cheng1,YING Li-biao2*

(1. College of Xingzhi, Zhejiang Normal University， Jinhua 321004， China; 2. Jinhua City Environmental Science Research Institute， Jinhua 321017， China)

Seven derivatives of imatinib(5a～5g)were prepared by condensation of substituted acid chlorides withN-(5-amino-2-methylphenyl)-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine amine, which was prepared from 2-methyl-5-nitroaniline through the reactions of addition, condensation, cyclization and reduction, respectively. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS. Theinvitroantitumor activities of 5a～5g against human hepatoma cells(HepG2), cervical cancer cells(Hela), lung cancer cells (H460) and breast cancer cells(MCF-7) were investgated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The results demonstrated that 5e exhibited good inhibition activities with IC50of 10.90±1.00 μmol·L-1, 8.51±0.90 μmol·L-1, 13.15±1.11 μmol·L-1and 14.75±0.78 μmol·L-1, respectively.

4-nitro-2-amino toluene; imatinib derivative; synthesis; MTT; anti-tumor activity

2016-07-15

嚴(yán)曉陽(1976-)，男，漢族，浙江東陽人，碩士研究生，主要從事精細(xì)有機(jī)合成和藥物化學(xué)的研究。 E-mail: eastmorningsun@163.com

應(yīng)禮彪，工程師， E-mail: jinhuayinggong@163.com

O625.6； O626.1

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16146