張彭湃，王松廷，楊生玉，朱金花，侯亞彬

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；　2.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 實驗室與設(shè)備處，河南 開封 475004)

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高效液相色譜法研究懷山藥啤酒中的山藥素類成分

張彭湃1，王松廷1，楊生玉1，朱金花2，侯亞彬3*

(1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；2.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004；3.河南大學(xué) 實驗室與設(shè)備處，河南 開封 475004)

建立一種有效的高效液相色譜方法，以期對懷山藥啤酒中的山藥素類成分進行分析. 測定方法為：色譜柱為Cosmosil 5C18-PAQ型(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇:水(體積比60:40)，流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長為274 nm，柱溫30 ℃. 在選定的色譜條件下，最終得到了穩(wěn)定、效果較好的懷山藥啤酒的液相色譜圖，并檢測到懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物成分，其平均回收率為87.71%.

高效液相色譜法；懷山藥啤酒；山藥素化合物

山藥在我國已經(jīng)有2000多年的食用歷史，隨著現(xiàn)代食品加工業(yè)的發(fā)展，以山藥為原料或添加山藥的食品和保健品越來越多. 例如，山藥啤酒、山藥醋、山藥酸奶等山藥發(fā)酵制品在我們的日常生活中越來越常見[1]. 這些山藥發(fā)酵制品能在保證食物良好口感的同時有效地利用山藥的藥理活性和保健功能，使所生產(chǎn)出的食品具有更豐富的營養(yǎng)，更好的滋補健身、養(yǎng)顏美容之功效[2]. 由于這些產(chǎn)品中添加有山藥，故推測其中應(yīng)該含有某些山藥中的活性成分如山藥素類化合物，但生產(chǎn)山藥啤酒、山藥醋等產(chǎn)品需經(jīng)過微生物發(fā)酵過程，山藥中所含的山藥素類成分有可能在發(fā)酵過程中發(fā)生了變化[3]. 因此，本文中我們以懷山藥啤酒為研究對象，探討懷山藥啤酒中山藥素化合物含量的變化.

山藥素類化合物是一種酚類化合物，高效液相色譜被認為是研究多酚類化合物最常用的方法[4]. YOON建立了HPLC分析方法來測定山藥素Ⅰ，HPLC條件是：色譜柱：Columbus 5μC18100A(4.6 mm×300 mm,5 μm),流動相：0.025%的乙酸溶液(A)和0.025%的乙酸乙腈溶液(B),檢測波長260 nm,流速2 mL/min,梯度洗脫[5].

本文中選擇山藥中含量較高的山藥素Ⅰ和山藥素Ⅰ衍生物(2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲)為參考指標(biāo)，同時由于山藥素Ⅳ和山藥素Ⅰ衍生物分離時間較接近，將山藥素Ⅳ也作為參考指標(biāo). 山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物、山藥素Ⅳ結(jié)構(gòu)如圖1所示.

A：山藥素Ⅰ， B：山藥素Ⅰ衍生物， C：山藥素Ⅳ.圖1　山藥素及其衍生物的結(jié)構(gòu)式Fig.1　Structural formula of batatasin and its derivatives

1　材料與方法

1.1材料與試劑

小麥啤酒、懷山藥啤酒均由河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實驗室提供；甲醇(天津市四友精細化學(xué)品有限公司出品，分析純)；山藥素Ⅰ(1.067 g/L)，山藥素Ⅰ衍生物(1 g/L)，山藥素Ⅳ(1 g/L)均由甲醇配制；高效液相色譜甲醇(德國默克公司，色譜純)；實驗中所用水均為超純水.

1.2儀器設(shè)備

依利特P230Ⅱ型高效液相色譜儀，配備UV230Ⅱ型紫外檢測器，ZWⅡ溫度控制器，色譜工作站軟件型號為EC2006(大連依利特分析儀器有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Anke離心機 (上海安亭科學(xué)儀器廠)；Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱；Phree Phospholipid Removal小柱(1.5 mL，美國菲羅門科學(xué)儀器有限公司).

1.3實驗方法

1) 分別量取懷山藥啤酒、小麥啤酒各40 mL于2個燒杯中，超聲處理30 min，用隔膜真空泵過濾后分別裝于離心管中并放4℃冰箱冷藏保存.

2) 取上述樣品各150 μL于Phree Phospholipid Removal小柱中，再分別添加600 μL色譜甲醇，振蕩混勻，將小柱放于離心管中，使樣品溶液以8000 r/mim離心3 min,將離心管中的液體移至1.5 mL試劑瓶中放于4 ℃冰箱保存，即得到2個過柱的樣品.

3) 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制. 分別取山藥素Ⅰ

(1.067 g/L)、山藥素Ⅰ衍生物(1 g/L)、山藥素Ⅳ(1 g/L)儲備液各50 μL于1.5 mL離心管中，再加入850 μL色譜甲醇，即得到50 mg/L的3種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液；用色譜甲醇逐級稀釋該混合液2、5、10、20倍得到的25 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L的3種標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液[6].

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的建立

2.1.1選擇檢測波長

查閱了相關(guān)文獻，綜合響應(yīng)值、分離度和穩(wěn)定性，選擇274 nm為檢測波長[7].

2.1.2流動相選擇

選擇甲醇-水作為流動相，考察了甲醇-水的體積比為70:30與60:40的分離情況和出峰時間，選擇后者作為流動相.

2.1.3色譜柱選擇

測試了Hypesil C18 (3.5 mm×150 mm, 5 μm)色譜柱以及Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色譜柱對樣品的分離效果，根據(jù)樣品分離程度和峰形選擇后者.

綜上確定了最終的色譜條件：采用COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6×250 mm，5 μm) 色譜柱，流動相為甲醇:水(體積比60:40)，流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長為274 nm，柱溫30℃，進樣量為20 μL. 在最佳色譜條件下，對山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物和山藥素IV的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分析，如圖2所示.

圖2　山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物及山藥素Ⅳ的標(biāo)準(zhǔn)品溶液譜圖Fig.2　Standard sample chromatogram of batatasinⅠ,batatasinⅠderivative and batatasin Ⅳ

2.2樣品前處理方式比較

之所以對樣品進行過小柱處理，是因為樣品中含有一些多糖、脂類等大分子物質(zhì)，這些大分子物質(zhì)可能會掩蓋樣品中含量較少的成分，使其檢測不出. 過小柱后，樣品中的大分子被除去，懷山藥啤酒中的山藥素類成分出峰的可能性將會大大提高，出峰效果也將有可能會改善[8]. 在上述色譜條件下分別進樣未過柱的懷山藥啤酒、小麥啤酒，結(jié)果如圖3、圖4所示.

圖3　未過柱的小麥啤酒(空白對照)Fig.3　Wheat beer of not throughing the column

圖4　未過柱的懷山藥啤酒Fig.4　Yam beer of not throughing the column

從未過柱的小麥啤酒(圖3)、懷山藥啤酒(圖4)色譜圖中可以看出，在0～5 min內(nèi)，有信號較強且較寬的樣品峰，除此之外幾乎檢測不到其他峰. 可能原因是由于在釀造啤酒的過程中使用了麥芽、啤酒花等原料，經(jīng)啤酒酵母發(fā)酵后產(chǎn)生了多糖、脂類等大分子物質(zhì)，所使用的色譜柱對這些大分子物質(zhì)保留能力較差，導(dǎo)致無法達到分離而被流動相較快的淋洗出色譜柱，形成較大的寬峰，從而可能會掩蓋其他的極性較大的成分[9]. 因此，需要對樣品進行進一步處理以消除干擾,分別將樣品過Phree Phospholipid Removal小柱，以除去其中的磷脂類成分及其他部分大分子[10]. 所得色譜圖如圖5、圖6所示，分別與圖3、圖4比較，過柱后的樣品在0～5 min的峰明顯變窄，且在10～15 min出現(xiàn)一個峰.

圖5　過柱小麥啤酒(空白對照)Fig.5　Wheat beer of throughing the column

圖6　過柱的懷山藥啤酒Fig.6　Yam beer of throughing the column

對比圖2標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時間，查閱相關(guān)文獻，結(jié)合實驗室前期工作，推測過柱的懷山藥啤酒、小麥啤酒在10～15 min所出的峰可能為山藥素Ⅰ衍生物. 本實驗所用樣品均過小柱處理(下文不再注明).

2.3樣品中10～15 min峰的歸屬

因懷山藥啤酒的色譜流出曲線中15 min之后均沒有出峰，所以首先可以排除它們含有山藥素Ⅰ的可能性. 雖然之前推測樣品在10～15 min所出的峰是山藥素Ⅰ衍生物，但由于山藥素IV和山藥素I衍生物均在10～15 min內(nèi)出峰且出峰時間較為接近，故在相同的色譜條件下對懷山藥啤酒樣品添加山藥素Ⅳ和山藥素I衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液進行驗證[11].

圖7　加標(biāo)(山藥素Ⅳ)的懷山藥啤酒Fig.7　Yam beer of adding the batatasin Ⅳ

由圖6可知，未加標(biāo)的懷山藥啤酒在10～15 min只出了一個峰，由圖7可知，加標(biāo)山藥素Ⅳ后的懷山藥啤酒在10～15 min出了兩個峰. 由于圖2和圖7色譜條件相同，而1號峰保留時間與山藥素Ⅳ的一致，且加標(biāo)后峰明顯增高，可以推知1號峰是所加標(biāo)準(zhǔn)物山藥素Ⅳ. 由于加標(biāo)山藥素Ⅳ后樣品中仍存在2號峰，那么2號峰可能是懷山藥啤酒本身所含成分所出的峰，而且2號小峰的保留時間與圖2中的山藥素Ⅰ衍生物保留時間基本一致. 需要進一步驗證樣品中10～15 min所出峰的歸屬[12]. 實驗在添加山藥素IV標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，又加入了山藥素I衍生物標(biāo)準(zhǔn)品，實驗結(jié)果如圖8、圖9所示.

圖8　稀釋2倍的圖7溶液Fig.8　Solution of 2-fold dilution for Fig.7

圖9　用100 g/L的山藥素Ⅰ衍生物稀釋2倍的圖7溶液Fig.9　Solution of 2-fold dilution with the batatasinⅠderivative of 100 g/L for Fig.7

對于懷山藥啤酒，比較圖8和圖9，可以發(fā)現(xiàn)圖7的溶液用不同的方式稀釋2倍后，1號山藥素Ⅳ的峰高由6.6 mV分別降為2.9 mV和3.03 mV,但2號未知峰的峰高在用山藥素Ⅰ衍生物稀釋時明顯增高，故可以確定山藥啤酒中2號峰是山藥素Ⅰ衍生物，加標(biāo)實驗結(jié)果表明，樣品中10～15 min所出的峰為山藥素Ⅰ衍生物，即懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物. 對比小麥啤酒，在相同實驗條件下均檢測出山藥素Ⅰ衍生物.

2.4線性關(guān)系考察

精確配制出一系列濃度的山藥素Ⅰ、山藥素Ⅰ衍生物、山藥素Ⅳ混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下進樣，每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣3次[13].

以峰面積為縱坐標(biāo)y，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得表1. 可以看出，在本實驗的色譜條件下，3種標(biāo)準(zhǔn)品在測定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.5樣品測定

按照上述色譜條件，分別對懷山藥啤酒和小麥啤酒中的山藥素Ⅰ衍生物的含量進行了測定，分別代入山藥素Ⅰ衍生物的回歸方程y=2.62×102x-312.86，結(jié)合過小柱稀釋倍數(shù)(5倍)，可以得到各樣品中山藥素I衍生物的含量，結(jié)果顯示，小麥啤酒和懷山藥啤酒兩種樣品中均含有山藥素Ⅰ衍生物，分別為8.33 mg/L與8.77 mg/L，二者山藥素Ⅰ衍生物的含量相差不大，作為空白對照的小麥啤酒中山藥素Ⅰ衍生物的含量略低于懷山藥啤酒[14].

根據(jù)本實驗的結(jié)果，沒有添加山藥的小麥啤酒也含有山藥素Ⅰ衍生物，由此可見，山藥素Ⅰ衍生物并非山藥中專屬化合物，山藥素Ⅰ衍生物的化學(xué)名稱是2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲，推測啤酒在釀造過程中可能會產(chǎn)生山藥素Ⅰ衍生物.

表1　標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程Table 1　The regression equation of standard sample

2.6回收率實驗

對懷山藥啤酒進行回收率實驗[15]. 因為懷山藥啤酒中的山藥素Ⅰ衍生物含量為1.75 mg/L(過柱后)，分別添加相當(dāng)于懷山藥啤酒自身所含山藥素Ⅰ衍生物濃度0.5倍、1倍、2倍的山藥素Ⅰ衍生物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，結(jié)合線性方程，最終求得平均回收率為97.17%.

3　結(jié)論

在本論文所采用的色譜條件下，各個實驗樣品、標(biāo)準(zhǔn)品均能得到穩(wěn)定性、峰型、分離程度等較好的色譜流出曲線，并且通過保留時間對照法和標(biāo)準(zhǔn)加入法等確定了小麥啤酒和懷山藥啤酒中含有山藥素Ⅰ衍生物成分. 實驗中所用的3種標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線在選定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好. 實驗待測樣品與空白對照品的山藥素Ⅰ衍生物的含量無顯著性差異，推測可能的原因是山藥素Ⅰ衍生物(2,4-二甲氧基-6,7-二羥基菲)的來源并非只有山藥，在啤酒釀造過程中也可能會產(chǎn)生山藥素Ⅰ衍生物. 最后還對懷山藥啤酒中山藥素Ⅰ衍生物進行了回收率實驗，其平均回收率為97.17%. 本方法簡單、快速，且提供了食品中含有復(fù)雜樣品基質(zhì)(如含有較多蛋白質(zhì)、脂類等大分子)的前處理方法，為樣品中山藥素化合物的測定提供了一定參考.

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[責(zé)任編輯：張普玉]

Detemination on batatasins in Yam beer by HPLC

ZAHNG Pengpai1, WANG Songting1, YANG Shengyu1, ZHU Jinhua2, HOU Yabin3*

(1.CollegeofLifeScience,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 3.LaboratoryandEquipmentAdministration,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Objective: Establish a suitable method to study batatasins in Yam beer by HPLC. Methods: Batatasins in Yam beer was identified by HPLC. The chromatographic column used was Cosmosil 5C18-PAQ (4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of methanol-water(volumn ratio is 60:40), with a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃ with detection wavelength at 274 nm. Results: The method is simple, reliable and suitable for detemination on batatasins in Yam beer. Batatasin Ⅰ derivative in Yam beer was identified. The average recovery of batatasin Ⅰ derivative was 87.17%.

HPLC; Yam beer; batatasin compounds

2016-01-17.

河南省高等學(xué)校重點科研項目資助計劃(17A530001).

張彭湃(1978-)，男，講師，研究方向為食品發(fā)酵.*

，E-mail: zdsys@henu.edu.cn.

TS262.5

A

1008-1011(2016)05-0603-06