武婷，段迎燕，田海嬌

（山西省分析科學(xué)研究院，太原 030006）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測果蔬中的吡氟甲禾靈殘留

武婷，段迎燕，田海嬌

（山西省分析科學(xué)研究院，太原 030006）

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測定果蔬中吡氟甲禾靈殘留的方法。樣品以乙腈勻漿提取，并采用Sep-Pak Vac型氨基固相萃取柱凈化樣品，采用超高效液相色譜柱WATERS ACQUITY C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以乙腈- 0.1%甲酸水溶液作為淋洗液進行梯度洗脫。吡氟甲禾靈在1.0～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2=0.997 7，加標(biāo)回收率為84.1%～88.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～3.58%（n=6）。該方法操作簡便，分析快速，提取效率高，重現(xiàn)性好，有實用價值。

超高效液相色譜-質(zhì)譜法；果蔬；吡氟甲禾靈

吡氟甲禾靈也稱氟吡甲禾靈，商品名蓋草能，是一種苗后選擇性除草劑。此類除草劑屬于脂肪酸合成抑制劑，芽后用于闊葉作物，如大豆、花生、棉花和甜菜等，可有效防除野燕麥、旱雀麥、馬唐、牛筋草、早熟禾、稗草、羅氏草等。吡氟甲禾靈具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性，雜草的莖葉接觸吡氟甲禾靈后很快將其吸收并輸導(dǎo)到整個植株，從而抑制莖和根的分生組織而導(dǎo)致雜草死亡，起到除草作用［1-3］。吡氟甲禾靈因具有選擇性除草活性和對人畜高度的安全性而被廣泛應(yīng)用，主要作為某些高毒高殘農(nóng)藥的替代品種在果蔬等作物上大量使用，但由于使用不當(dāng)?shù)仍蛲鶗斐墒卟怂茸魑镏袣埩袅棵黠@超標(biāo)。

我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2012 《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對吡氟甲禾靈的最大殘留量作了相應(yīng)的規(guī)定：吡氟甲禾靈在大豆、花生仁中的最大殘留限量為0.1 mg/kg，在棉籽中的最大殘留量為0.2 mg/kg，在甘藍(lán)中的最大殘留限量為0.2 mg/kg［4］。

吡氟甲禾靈的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［5-8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［9-11］、高效液相色譜法（HPLC）［12］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）［13］和酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）［14］。筆者建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測果蔬中吡氟甲禾靈殘留量的分析方法，采用超高效液相色譜進行分離，分離時間大大縮短，三重四級桿質(zhì)譜檢測器具有更高的靈敏度和分離度。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：ACQUITY UPLC XEVO TQ型，美國Waters公司；

組織搗碎機：Retsch GM200型，德國Retsch公司；

高速離心機：TGL-16M型，長沙湘智離心機儀器有限公司；

氮吹儀：N-EVAP型，美國Organomation公司；

氨基固相萃取柱：Sep-Pak Vac型，美國Supelco公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

超純水機：明澈-D24UV型，美國Millipore公司；

吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，美國Fisher公司；甲苯：優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

氯化鈉：優(yōu)級純，天津市北辰方正試劑廠；

無水硫酸鈉：分析純，天津市北辰方正試劑廠，用前于650℃灼燒4 h，貯于干燥器中，冷卻后備用；

吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.00 mg/mL，精密稱取吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至標(biāo)線，臨用時用乙腈稀釋至所需的濃度。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY C18柱（50 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；進樣體積：10 μL；柱溫：40℃；流量：0.5 mL/min；流動相：0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸混合液，梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：900 L/h；碰撞氣流量：0.17 mL/min；母離子：m/z 434.1；子離子：m/z 316（定量），288；錐孔電壓：25 V；碰撞能量：20，30 eV；

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1 提取

取20 g樣品（精確至0.01 g）于80 mL聚丙烯離心管中，加入40 mL乙腈，用組織搗碎機高速（15 000 r/min）勻漿提取1 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，以3 800 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液20 mL（相當(dāng)于10 g試樣量），于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至1 mL，待凈化。

1.3.2 凈化

加入高度約2 cm的無水硫酸鈉于Sep-Pak Vac型氨基固相萃取柱中，置于下接雞心瓶的固定架上。加樣前先用4 mL乙腈-甲苯混合液（3+1）預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至凈化柱上，并更換新雞心瓶進行接收。再每次用2 mL乙腈-甲苯混合液（3+1）洗滌樣液瓶3次，將洗滌液移入柱中。在萃取柱上裝配50 mL貯液器，用25 mL乙腈-甲苯混合液（3+1）洗脫農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品，合并于雞心瓶中，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1 mL乙腈-水（3+2），混勻，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾，供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相條件的優(yōu)化

因吡氟甲禾靈在C18柱上的保留性強，所以選擇C18柱進行分析。選擇甲醇和乙腈作為有機相、水和0.1%甲酸水溶液作為水相，通過不同組合（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）進行試驗，結(jié)果表明使用乙腈作為有機相、0.1%甲酸水溶液作為水相，可增強吡氟甲禾靈的電離并改善色譜峰形，提高峰的響應(yīng)值，增加方法的靈敏度，且出峰時間大大縮短。因此最終確定乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先通過一級質(zhì)譜全掃描得到吡氟甲禾靈的分子離子峰［M+H］+（m/z 434.1）；然后調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、錐孔流量、脫溶劑氣流量、錐孔電壓，使吡氟甲禾靈分子離子峰的響應(yīng)值達(dá)到最大；再對［M+H］+進行二級質(zhì)譜分析，通過優(yōu)化碰撞氣流量和碰撞能量，確定m/z 434.1，316及m/z 434.1，288為特征離子對。因為m/z 434.1，288離子對的響應(yīng)值較m/z 434.1，316低，靈敏度偏低，所以選擇m/z 434.1，316為定量離子對，m/z 434.1，288為輔助定性離子對。

在最優(yōu)色譜條件和質(zhì)譜條件下，吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM圖見圖1。

圖1 吡氟甲禾靈的標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM圖

2.3 線性關(guān)系和檢出限

選擇不含有吡氟甲禾靈的甘藍(lán)為果蔬樣品代表。準(zhǔn)確稱取20 g（精確至0.01 g）未添加吡氟甲禾靈的甘藍(lán)勻漿液，準(zhǔn)確加入吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中吡氟甲禾靈的質(zhì)量濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 ng/mL，分別對該系列加標(biāo)溶液進行UPLC-MS/MS分析，記錄MRM圖，計算色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以各溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸。得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性方程為y=62.54x-9.894 5，相關(guān)系數(shù)r2=0.997 7，線性關(guān)系良好，符合方法學(xué)要求。

將吡氟甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋后，分別進行UPLC-MS/MS分析，記錄MRM圖中定量離子的信噪比，以3倍信噪比計算，得吡氟甲禾靈的檢出限為1.0 ng/mL。

2.4 加標(biāo)回收試驗

選擇不含吡氟甲禾靈的甘藍(lán)，分低、中、高3個濃度水平，加入適量氟吡甲禾靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中吡氟甲禾靈的添加量為0.125，0.25，0.50 μg/kg，每個濃度水平平行6份，然后按本方法進行提取和凈化，按照色譜、質(zhì)譜方法進樣分析。加標(biāo)樣品的MRM圖見圖2，精密度試驗和加標(biāo)試驗結(jié)果分別見表2、表3。由表2、表3可知，在0.125，0.25，0.5 μg/kg 3個添加水平下，甘藍(lán)樣品中吡氟甲禾靈測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～3.58%（n=6），加標(biāo)回收率在84.1%～88.6%之間，滿足GB/T 27404-2008《 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢驗》［15］中對檢測重復(fù)性的要求。

圖2 加標(biāo)樣品的MRM圖

表2 精密度試驗結(jié)果

表3 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測果蔬樣品中吡氟甲禾靈殘留量的分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取、SPE 凈化后，背景值顯著降低，定量檢測靈敏度明顯提高，滿足農(nóng)藥最大殘留限量的要求。同時，通過優(yōu)化離子對的選擇，較好地排除了基質(zhì)干擾。該法可應(yīng)用于果蔬中吡氟甲禾靈殘留的定性與定量檢測，為農(nóng)藥殘留的監(jiān)控和風(fēng)險評估提供一種可靠的分析途徑。

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［15］ GB/T 27404-2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測［S］.

我國食品檢測技術(shù)發(fā)展迅速

隨著人們生活水平的不斷提高，人們的食品消費觀念在逐漸變化，消費方式出現(xiàn)從家庭烹飪轉(zhuǎn)向市場消費的趨勢，導(dǎo)致食品安全隱患和風(fēng)險逐漸增加。食品企業(yè)只有從根本上解決食品安全隱患才能獲得國際市場的準(zhǔn)入，實現(xiàn)我國食品的對外貿(mào)易。在這種要求下，食品檢測技術(shù)必須要滿足快速、方便、準(zhǔn)確和靈敏的要求。

（1）農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)。農(nóng)藥殘留一直是影響食品安全的主要因素，近年來，農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)取得了很大的突破，出現(xiàn)了包括微波萃取法、超臨界提取法、固相萃取法及加熱溶劑萃取法等新的提取、凈化、分離和檢測技術(shù)，這些新的檢測技術(shù)使得提取液中的雜質(zhì)少，提取對象效率高，試劑耗費少，而且操作簡單，檢測質(zhì)量高。

（2）獸藥殘留的檢測技術(shù)。隨著我國畜牧業(yè)的集約化和規(guī)模化的發(fā)展，獸藥的使用范圍越來越廣，各種有利于促進畜禽生長的抗生素、磺胺藥、激素等在畜牧養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，這些獸藥在促進畜禽生長，減少動物發(fā)病率的同時，也帶來了獸藥殘留的問題。目前獸藥殘留成為肉食品安全的最大隱患。一些工業(yè)發(fā)達(dá)國家在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)建立了獸藥殘留檢測體系，而我國的獸藥檢測體系尚不健全，起步較晚，但是近些年來我國政府在獸藥檢測方面加大了重視程度，而且取得了明顯的進展，如通過試劑盒檢測飼料中的超標(biāo)污染物，以及在生豬屠宰時檢測瘦肉精的含量等這種方法。

（3）重要有機污染物的檢測技術(shù)。隨著工業(yè)的不斷發(fā)展，人們生存的環(huán)境受污染程度越來越嚴(yán)重，在工業(yè)生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生很多有機污染物，這些污染物在我們的身邊隨處可見，尤其是垃圾焚燒過程更是產(chǎn)生了大量的諸如二噁英等嚴(yán)重危害人們身心健康的污染物。二惡英類物質(zhì)大約有200多種，是一種高致癌性的物質(zhì)，據(jù)科學(xué)檢測得知，二惡英的毒性是砒霜的900倍，不僅毒性強，而且分析難度大，檢測費用高昂。目前我國在二惡英檢測方面已經(jīng)建立了專門的檢測機構(gòu)和檢測體系，在甲醛的檢測方面也取得了突破，已經(jīng)使用到了分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法等，這些檢測方法設(shè)備操作簡單，干擾度低，成本低，靈敏度高。

（4）生物性污染的檢測技術(shù)。食品里面由微生物引起的主要食源性疾病有沙門氏菌病、螺旋桿菌病、腸出血性大腸桿菌及李斯特菌引起的感染性疾病，以及黃曲霉素引起的致癌性病變等。目前，以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)以及自動化儀器的迅速發(fā)展推動了微生物檢測技術(shù)的進步，目前使用的酶聯(lián)免疫試劑盒在食源性病毒的檢測方面取得了明顯的效果。

（5）轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)。轉(zhuǎn)基因食品因其安全性一直無法得知而無法得到市場的認(rèn)可，美國作為轉(zhuǎn)基因工程的研究大國，在國內(nèi)禁止轉(zhuǎn)基因作物的種植，而在我國，轉(zhuǎn)基因食品大量存在于市場之中，2015年，湖北省層統(tǒng)計過全省有3/5的農(nóng)產(chǎn)品為轉(zhuǎn)基因食品，一度引起人們的恐慌。轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法常見的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫分析法，實時熒光PCR檢測技術(shù)及測試試劑盒的出現(xiàn)意味著我國在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面突破了最大的難關(guān)。

（中國分析計量網(wǎng)）

快速細(xì)菌感染檢測或降低抗生素的濫用

來自牛津大學(xué)的研究人員通過研究表示，利用5 min快速檢測法或許可以降低治療呼吸道感染的抗生素濫用現(xiàn)象，而且降低不必要的抗生素使用是目前全世界抑制抗生素耐藥感染的關(guān)鍵方法，相關(guān)研究刊登于國際雜志The Lancet Global Health上。

這種快速檢測方法可以檢測患者血液中的C反應(yīng)蛋白（CRP），CRP是細(xì)菌引發(fā)感染的標(biāo)志物，低水平CRP可以提示機體的病毒感染，從而使得抗生素療法或許可以免于進行。研究者在越南河內(nèi)的10個主要的健康護理中心進行這項測試，同時研究者還對隨機對檢測或未檢測CRP的2000名患者的抗生素使用記錄進行了分析。結(jié)果表明，雖然患者臨床恢復(fù)相同，但成年人和兒童的抗生素的使用情況也會發(fā)生明顯下降，這項試驗中研究者首次對資源匱乏地區(qū)的人群進行了調(diào)查，而且調(diào)查結(jié)果與歐洲進行的試驗結(jié)果相似。

越南是世界上第十四個經(jīng)濟快速發(fā)展的國家，抗生素的無監(jiān)管使用使得越南人對抗生素的耐藥性異常敏感；而且感染性疾病依然是引發(fā)越南人死亡的主要原因，抗生素耐藥性可以抵抗許多治療感染性疾病的療法；2014年WHO數(shù)據(jù)顯示，社區(qū)和醫(yī)院常見細(xì)菌的抗生素耐藥性已經(jīng)達(dá)到了全世界預(yù)警的水平了，因此開發(fā)快速診斷技術(shù)，降低不必要抗生素的使用或許是抵御抗生素耐藥性的一種最佳的方法。

（中國分析計量網(wǎng)）

Determination of Haloxyfop-methyl Residue in Fruits and Vegetables by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wu Ting， Duan Yingyan， Tian Haijiao
（Shanxi Academy of Analytical Science， Taiyuan 030006， China）

A method for determination of haloxyfop-methyl residue in fruits and vegetables was developed by using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）. The samples were extracted by acetonitrile firstly and the extracts were cleaned using Sep-Pak Vac-SPE column， the extracts were then separated by a WATERS ACQUITY C18column （50 mm×2.1 mm，1.7 μm） utilizing gradient elution with acetonitrile-0.1% formic acid. The linear relationship was fine in the concentration range of 1.0-50.0 ng/mL with r2of 0.997 7， the recoveries were in the range of 84.1%-88.6%， RSDs were in the range of 1.18%-3.58%（n=6）. The method has the advantage of simple operation，rapid analysis， high extraction efficiency， good reproducibility and practical value.

ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry； fruits and vegetables； haloxyfopmethyl

O657.7

A

1008-6145（2016）05-0068-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.05.018

聯(lián)系人：武婷；E-mail： cau6281@126.com

2016-07-14