布雅楠，楊照生，閆正，羅丹，張玲玲

（河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002）

含羞草中總黃酮的提取與分離純化*

布雅楠，楊照生，閆正，羅丹，張玲玲

（河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定 071002）

確定含羞草中總黃酮的最佳提取部位，并對其初步分離純化。通過正交試驗，分別篩選含羞草根部、莖葉及種子中總黃酮的最優(yōu)提取條件，比較三者黃酮總含量，最終確定提取部位為莖葉，最佳提取條件：以70%乙醇為溶劑，按照1∶8配料比，在55～58℃下超聲50 min。提取液依次用石油醚、乙酸乙酯液液萃取，蒸干上樣，用乙醇水溶液以4 mL/min梯度洗脫Diaion HP-20大孔樹脂，收集洗脫液并用液相色譜監(jiān)測每個梯度洗脫液的總黃酮含量，得到分離純化過的黃酮類物質。當40%乙醇洗脫部位總黃酮含量最高，達57.7%。該工藝確定了含羞草中莖葉部位總黃酮含量最高，大孔樹脂初步純化黃酮類物質有效，為含羞草中黃酮類物質的應用提供了依據(jù)。

含羞草；黃酮類物質；正交試驗；大孔樹脂

含羞草為豆科含羞草屬多年生草本植物。具有頑強的生長力，在我國多地均有栽培，資源豐富。含羞草全草富含黃酮類、酚類、氨基酸、有機酸、含羞草堿等物質，具有清熱利尿、化痰止咳、安神止痛、解毒、散瘀、止血等功效，可入藥［1］。其中黃酮類物質具有抗腦缺血、抗心肌缺血、抗心律失常、抗氧化、抗自由基、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用［2-4］。

黃酮類物質廣泛存在于植物的莖葉、根部、種子、花等部位。有文獻對含羞草全草中總黃酮的提取方法進行了優(yōu)化［5-6］，采用柱色譜分離純化總黃酮，并對已純化黃酮類物質進行了表征［7-12］，定性得到黃酮苷及黃酮碳苷等物質。目前含羞草中總黃酮的主要存在部位未見文獻對照，筆者首次系統(tǒng)地比較了含羞草的莖葉、根部、種子3個部位的總黃酮含量，確定含羞草中總黃酮的提取部位，使用大孔樹脂對其初步分離純化，得到黃酮類化合物。該研究可為含羞草中總黃酮的工業(yè)化提取及臨床應用提供參考，以及含羞草資源的開發(fā)利用奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000型，美國賽默飛世爾科技公司；

紫外可見分光光度計：UNIC 7200型，上海尤尼柯儀器有限公司；

超聲波清潔器：SK5200H型，上?？茖鍧嵱邢薰?；

自動雙重純水蒸餾器：SZ-93型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D（Ⅲ）型，鞏義市予華儀器有限公司；

粉碎機：轉速為25 000 r/min，浙江武義鼎藏日用金屬制品廠；

架盤藥物天平：感量為0.1 g，上海精科儀器有限公司；

蘆?。簶藴蕵悠?，上海阿拉丁生化科技有限公司；

大孔吸附樹脂：Diaion HP-20型，日本三菱化學公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯：分析純，天津華東試劑廠；

甲醇：色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；

含羞草莖葉、根部、種子均采自海南；

實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

分別將含羞草莖葉、根部、種子樣品于105℃烘干至恒重，粉碎后過250 μm（60目）標準篩，備用。

1.2.2 黃酮類物質提取

分別稱取3.0 g處理好的含羞草莖葉、根部、種子樣品，依次提取黃酮類物質。向莖葉樣品中加入70%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于55～58℃下超聲50 min；向根部樣品中加入50%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于40～44℃下超聲30 min；向種子樣品中加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于40～44℃下超聲50 min。然后真空抽濾提取液，洗滌定容至50 mL，搖勻，待測。

1.2.3 定量方法

選用蘆丁標準樣品作為對照品，通過測定蘆丁的吸光度，以標準曲線法定量計算樣品中總黃酮含量。

蘆丁系列標準溶液的配制：準確稱取烘干至恒重的蘆丁標準樣品，用甲醇配制成質量濃度為0.103 g/L的蘆丁標準溶液。分別移取蘆丁標準溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL于6只10 mL容量瓶中，各加甲醇至約5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL，以甲醇定容至標線，搖勻備用。

標準工作曲線的繪制：將蘆丁系列標準溶液靜置15 min，以相應試劑為空白，于510 nm下測定其吸光度。以蘆丁的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準工作曲線。線性回歸方程：y=10.477 12x+0.008 38，線性相關系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為0.010 3～0.091 2 g/L。

2 結果與討論

2.1 含羞草莖葉單因素試驗

2.1.1 溶劑組成對黃酮提取率的影響

稱取5份處理的含羞草莖葉于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入40%，50%，60%，70%，80%的乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，于30～34℃超聲50 min，抽濾，以對應溶劑洗滌定容，用1.2.3法平行測定3次。結果表明，隨乙醇體積分數(shù)增加，總黃酮提取率先增后減，使用70%乙醇水溶液時達到最高。

2.1.2 配料比對黃酮提取率的影響

稱取4份處理的含羞草莖葉于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入60%乙醇水溶液18，21，24，27 mL，對應物料比分別為1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，浸泡30 min，于30～34℃ 超聲50 min，抽濾，以對應溶劑洗滌定容，用1.2.3法平行測定3次。結果表明，隨溶劑量增加，總黃酮提取率先增后減，配料比為1∶7時達到最高。

2.1.3 超聲溫度對黃酮提取率的影響

稱取5份處理的含羞草莖葉于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，分別于30～34℃，40～44℃，50～54℃，55～58℃，58～60℃超聲50 min，抽濾，以60%乙醇水溶液洗滌定容，用1.2.3法平行測定3次。結果表明，隨溫度升高，黃酮提取率逐漸增加，最后趨于穩(wěn)定，于55～58℃時達到最高。

2.1.4 超聲時間對黃酮提取率的影響

稱取5份預處理的含羞草莖葉于100 mL具塞錐形瓶中，每份3.0 g，分別加入60%乙醇水溶液24 mL，浸泡30 min，分別于30～ 34℃超聲10，20，30，40，50 min，抽濾，以60%乙醇水溶液洗滌定容，用1.2.3法平行測定3次。隨超聲時間增加，黃酮提取率先增后減，于超聲50 min時達到最高。

2.2 含羞草根部單因素試驗

按照2.1方法進行含羞草根部單因素試驗，結果表明，隨乙醇體積分數(shù)增加，總黃酮提取率先增后減，使用50%乙醇水溶液時達到最高；隨溶劑量增加，總黃酮提取率先增后減，物料比為1∶7時達到最高；隨溫度升高，黃酮提取率逐漸增加，最后趨于穩(wěn)定，于58～60℃時達到最高；隨超聲時間增加，黃酮提取率先增后減，于超聲20 min時達到最高。

2.3 含羞草種子單因素試驗［13］

按照2.1方法進行含羞草種子單因素試驗，結果表明，隨乙醇體積分數(shù)增加，總黃酮提取率先增后減，使用50%乙醇水溶液時達到最高；隨溶劑量增加，總黃酮提取率先增后減，物料比為1∶8時達到最高；隨溫度升高，黃酮提取率逐漸增加，最后趨于穩(wěn)定，于55～58℃時達到最高；隨超聲時間增加，黃酮提取率先增后減，于超聲20 min時達到最高。

2.4 正交試驗

基于含羞草莖葉、根部、種子的單因素試驗，選擇4因素3水平進行正交試驗，結果分別見表1、表2、表3［13］。

表1 含羞草莖葉提取正交試驗

表2 含羞草根部提取正交試驗

表3 含羞草種子提取正交試驗

由表1可知，影響含羞草莖葉中黃酮提取率因素的主次順序：乙醇體積分數(shù)＞物料比＞超聲時間＞超聲溫度。綜合考慮，乙醇體積分數(shù)為70%、物料比為1∶8、超聲溫度為55～58℃、超聲時間為50 min時含羞草莖葉提取效果最佳；由表2可知，影響含羞草根部黃酮提取率的因素主次順序為：乙醇體積分數(shù)＞超聲溫度＞物料比＞超聲時間，綜合考慮，乙醇體積分數(shù)為50%、物料比為1∶7、超聲溫度為40～44℃、超聲時間為30 min時含羞草根部提取效果最佳；由表3可知，影響含羞草種子中黃酮提取率的因素主次順序：乙醇體積分數(shù)＞超聲時間＞物料比＞超聲溫度，綜合考慮，乙醇體積分數(shù)為60%、物料比為1∶8、超聲溫度為40～44℃、超聲時間為50 min時含羞草種子提取效果最佳。

2.5 含羞草莖葉、根部、種子黃酮含量比較

在最佳條件下對含羞草莖葉、根部、種子進行提取，用1.2.3法測定總黃酮含量，莖葉部分總黃酮含量為44.9 mg/g，根部總黃酮含量為93.0 mg/g，種子總黃酮含量為0.367 mg/g。種子中總黃酮量過少，不適合進一步工業(yè)化提?。桓侩m然總黃酮含量較高，但在整株質量中占比較低，且存在不易采樣、清洗、粉碎、工業(yè)量化提取等缺點；而含羞草莖葉部分在總植株質量中占比近90%，且易于采樣和初步處理，工業(yè)量化提取方便，故最終提取時以含羞草莖葉作為樣品，進一步分離純化。

2.6 黃酮類物質的純化

2.6.1 黃酮粗提取

取含羞草莖葉10 kg粉碎，用70%乙醇水溶液按1∶8配料比浸泡30 min，于55～58℃下超聲50 min提取，抽濾。粗提液旋蒸至無醇味，依次用3倍體積石油醚、乙酸乙酯萃取至無色，乙酸乙酯萃取液于35℃旋蒸至浸膏狀，備用。

2.6.2 大孔樹脂純化黃酮

采用Diaion大孔樹脂對黃酮粗提取物進行分離純化［14-15］。用無水乙醇浸泡Diaion HP-20大孔樹脂24 h，濕法裝填層析柱（100 cm×2.5 cm），將乙酸乙酯浸膏上樣，分別用0%，20%，40%，60%，80%，100%無水乙醇梯度淋洗，調(diào)節(jié)流量為4 mL/min，每100 mL洗脫液使用高效液相色譜儀監(jiān)測（100%甲醇，1.5 mL/min，260 nm），各梯度洗脫液中黃酮濃度先增后減，當濃度再次上升時，即為下一洗脫液梯度，合并同一梯度洗脫液組分，蒸干，稱重，結果見表4。由表4可知，乙醇體積分數(shù)為40%時，洗脫液中黃酮含量最高。

表4 淋洗劑對黃酮純化的影響 %

3 結論

通過正交試驗考察黃酮最佳提取條件，比較各部分總黃酮含量，考慮各部分占植株質量分數(shù)，確定莖葉為最終提取部位。大量提取后，使用液液萃取得到乙酸乙酯部分浸膏，以Diaion HP-20大孔樹脂初步分離純化，確定以40%乙醇水溶液洗脫洗脫液中比重最大，總黃酮含量最高。

根據(jù)實驗結果得到黃酮的提取純化工藝：新鮮含羞草莖葉→干燥后粉碎→最優(yōu)條件超聲提取→提取液→減壓濃縮→石油醚萃取→水層用乙酸乙酯萃取→乙酸乙酯萃取液旋蒸至浸膏→浸膏上Diaion HP-20大孔樹脂柱→乙醇水梯度洗脫→每100 mL洗脫液以液相色譜儀監(jiān)測→將40%乙醇洗脫液合并，減壓濃縮至浸膏→樣品。

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興奮劑檢測有望幾分鐘出結果

澳洲的研究人員正在改善警方進行路邊臨檢的檢測技術，這種技術未來可以用在奧運等運動賽事，大幅縮短運動禁藥檢測的時間。

目前運動禁藥檢測仍需要采集運動員的血液及尿液，而且可能需時數(shù)天才能獲得檢測結果。南澳大學教授佛克爾（Nico Voelcker）表示，血液檢驗具有很大的侵入性，尿液檢驗則可能會被摻入其它成分，而兩種檢驗都需花上數(shù)小時才能獲得結果，檢體在這段期間可能會遺失，或與其它選手的檢體混淆。

佛克爾說，WADA的補助款項讓他們能在明年修正檢驗技術，只要有運動員的唾液和汗水，就能檢驗他們有沒有使用能提升運動表現(xiàn)的禁藥，而且?guī)追昼妰?nèi)就能獲得結果。

他表示，市場不斷出現(xiàn)能提升運動表現(xiàn)的物質，但目前的檢測方式卻無法快速反應這股趨勢。他指出，新技術是針對分子進行檢測，“我們會先用雷射光激發(fā)高表面積物質，進而將分子釋放出來，然后再用質譜儀檢測這些分子。這種特別的技術不僅能夠檢測某一種特別的藥物，還能檢測許多可能已進到體內(nèi)的藥物”。

（中國分析計量網(wǎng)）

上海擬修法固化食品安全信息追溯管理制度

不久前，在上海市政府新聞辦舉行的發(fā)布會上得知，上海正在修訂《上海市實施〈中華人民共和國食品安全法〉辦法》，目前已形成修訂草案并報市政府法制辦審核。

上海市食品藥品監(jiān)督管理局局長閻祖強表示，《辦法（修訂草案）》將體現(xiàn)上海市近年來在食品安全監(jiān)管實踐中所形成的制度成果，把上海市實施全程監(jiān)管的食品安全信息追溯管理制度，以及餐廚廢棄油脂管理、食品安全責任保險、農(nóng)村集體聚餐等監(jiān)管經(jīng)驗以地方立法予以固化。

（網(wǎng)易財經(jīng)）

Extraction and Purification of Flavonoids in Mimosa

Bu Yanan， Yang Zhaosheng， Yan Zheng， Luo Dan， Zhang Lingling
（College of Chemistry and Environmental Science ， Hebei University， Baoding 071002， China）

The extracted parts of mimosa was confirmed and a feasible process was developed to simultaneously separate and purify flavonoids in it. The optimal extraction conditions of total flavonoids in plant stem leaves， roots and seeds of mimosa were picked out by orthogonal experiment. Considering total flavonoids content， the final extracted part was confirmed as plant stem leaves， the optimum extraction conditions were 70% ethanol according to 1∶8 ratio， ultrasound extracted at 55-58℃for 50 min. Petroleum ether and ethyl acetate were used to extract the extracts in sequence， and then dried， Diaion HP-20 macroporous resin were gradient eluted with ethanol aqueous at a rate of 4 mL/min， each gradient part of total flavonoids were collected by HPLC， the preliminary purified and separated flavonoids was got. 40% ethanol elution fraction contents the most highest total flavonoids about 57.7%. The process confirmed that the stem leaves content the highest flavonoids in mimosa and macroporous resin were effective in initial purification of flavonoids， which provided the basis for the application of flavonoids in mimosa.

Mimosa； flavonoids； orthogonal experiment； macroporous resin

0657.5

A

1008-6145（2016）05-0012-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.05.003

*國家自然科學基金項目（31370051）

聯(lián)系人：閆正；E-mail： yanzh@hbu.edu.cn

2016-07-22