董利平　崔玉環(huán)　趙寶民　連晶晶　魏玉磊　顏　娟　鄭茂東　劉占礦

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，張家口　075000)

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柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對大鼠缺血/再灌注損傷中Th1/Th2平衡的影響

董利平崔玉環(huán)趙寶民連晶晶1魏玉磊2顏娟3鄭茂東3劉占礦

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院老年科，張家口075000)

目的探討柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷對大鼠缺血/再灌注損傷中Th1/Th2細(xì)胞平衡的影響。方法采用線栓法建立大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，將健康雄性SD大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，按再灌注不同時間點分為6、12、24、48、72 h五個亞組；應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測單、雙鏈DNA斷裂損傷率，酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定Th1/Th2比值。結(jié)果腦缺血/再灌注后存在細(xì)胞DNA斷裂損傷，給予柴胡皂苷d+黃芩苷藥物保護后其DNA損傷率降低(P<0.01)。缺血/再灌注后干擾素(INF)-γ/白介素(IL)-4比值增加(P<0.01)，并隨缺血/再灌注時間延長呈動態(tài)變化，于24 h達最高峰，給予藥物干預(yù)后比值降低，并于24 h表達最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最顯著(P<0.01)。結(jié)論柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷可能是通過維持Th1/Th2細(xì)胞平衡實現(xiàn)其對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。

柴胡皂苷d；黃芩苷；Th1/Th2比值

在缺血性腦血管病發(fā)生發(fā)展及治療過程中，腦缺血/再灌注損傷的病理生理過程起著重要的作用。研究證實Th1/Th2細(xì)胞失衡與缺血/再灌注損傷相關(guān)聯(lián)〔1～4〕。本試驗選取柴胡的主要活性成分柴胡皂苷d、黃芩的主要活性成分黃芩苷，探討其在腦缺血/再灌注損傷中的神經(jīng)保護機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組180只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，重量(250±10)g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部，隨機分成正常組、假手術(shù)組、模型組、柴胡皂苷d組、黃芩苷組、柴胡皂苷d+黃芩苷組，每組30只，按再灌注不同時間點分為6、12、24、48、72 h五個亞組。

1.2藥物與試劑柴胡皂苷d購自Sigma-Aldrich公司；黃芩苷購自Sigma-Aldrich公司；栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；大鼠白介素(IL)-4、干擾素(INF)-γ ELISA檢測試劑盒購自Biosource公司。

1.3制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型大鼠稱重，腹腔注射麻醉7%水合氯醛(5 ml/kg)，采用改進Longa線栓法，暴露右側(cè)頸外動脈并剪開，將栓線推至大腦中動脈開口處，阻斷大腦中動脈血流，導(dǎo)致腦缺血，固定栓線，2 h后拉出栓線，恢復(fù)血液供應(yīng)，完成腦缺血/再灌注損傷模型；假手術(shù)組不實施缺血再灌注，只進行手術(shù)。

1.4用藥方法腦缺血/再灌注手術(shù)后2 h柴胡皂苷d組(70 mg/kg)、黃芩苷組(30 mg/kg)、柴胡皂苷d(70 mg/kg)+黃芩苷(30 mg/kg)組采用腹腔注射藥物，正常組、假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，各組均每天早晨給藥1次。

1.5神經(jīng)功能損傷評分動物清醒后，采用Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進行系統(tǒng)評分：0分：行為正常；1分：對側(cè)前爪輕微不對稱，不能充分伸展；2分：行走時連續(xù)向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：顫抖不穩(wěn)并跌倒，行走時向?qū)?cè)傾斜；4分：意識喪失，不能行走；符合1～3分者大鼠納入實驗，其余剔除。

1.6單細(xì)胞凝膠電泳(Came assay)檢測缺血/再灌注病灶中單、雙鏈DNA斷裂程度在相應(yīng)時點斷頭處死大鼠，在冰盤上將缺血半球去除額極、枕極及矢狀縫內(nèi)側(cè)各2 mm的大腦皮質(zhì)和基底節(jié)，余腦組織勻漿，機械研磨法制備單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1×1012/L。制膠、裂解、電泳、EB染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞圖像，每張玻片計數(shù)200個細(xì)胞中拖尾細(xì)胞(遷移距離>70 μm的細(xì)胞定位拖尾細(xì)胞)所占的百分?jǐn)?shù)作為評價DNA單、雙鏈斷裂的指標(biāo)。

1.7酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血漿中Th1/Th2比值的情況取靜脈血3 ml，常規(guī)分離血清，置-20℃冰箱待測。組織總蛋白溶解液及靜脈血中Th1/Th2檢測均按ELISA試劑盒內(nèi)附說明書操作，以INF-γ/IL-4的比值反映Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析釆用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對數(shù)據(jù)的組間比較行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)功能行為學(xué)評分正常組與假手術(shù)組的神經(jīng)功能行為學(xué)評分為0。與模型組相比，藥物干預(yù)組神經(jīng)功能行為學(xué)評分有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最顯著(P<0.01)。見表1。

2.2腦組織DNA單、雙鏈斷裂損傷程度與假手術(shù)組及正常組相比，模型組DNA損傷率明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，藥物干預(yù)組明顯下降(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最顯著(P<0.01)。見表2，表3。

2.3Th1/Th2比值的情況與假手術(shù)組及正常組相比，模型組細(xì)胞因子INF-γ/IL-4的比值增加，提示機體存在免疫失衡，主要以Th1細(xì)胞因子表達異常為主；而給予藥物干預(yù)后INF-γ/IL-4的比值降低，T細(xì)胞向Th1表型轉(zhuǎn)化減少，提示可能通過特異性調(diào)節(jié)IL-4的基因表達，進而抑制INF-γ表達，阻止T細(xì)胞向Th1表型轉(zhuǎn)化；且柴胡皂苷d+黃芩苷組效果最顯著(P<0.01)。見表4。

表1　腦缺血/再灌注后不同時間神經(jīng)功能行為學(xué)評分±s,n=6)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與同時間模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

表2　缺血/再灌注后不同時間腦組織的DNA單鏈斷裂損傷率±s,%，n=6)

表3　缺血/再灌注后不同時間腦組織的DNA雙鏈斷裂損傷率±s,%，n=6)

表4　缺血/再灌注后不同時間血漿INF-γ/IL-4比值比較

3　討　論

經(jīng)典的Th1/Th2模式認(rèn)為CD4+T細(xì)胞在受到抗原刺激后分化為2種表型：炎性反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞(Th1)和輔助性效應(yīng)細(xì)胞(Th2)〔1〕。研究表明，CD4+T細(xì)胞參與了腦缺血/再灌注損傷過程〔2〕，在血流再通的早期階段，T細(xì)胞活性被部分激活，導(dǎo)致組織損傷，雖然其機制尚未完全闡明，但很可能是通過Th1細(xì)胞分泌某些促炎性因子(IL-2、IL-12、INF-γ及TNF-α等)產(chǎn)生〔3〕；而Th2細(xì)胞可以通過分泌IL-4等抗炎性因子，實現(xiàn)對缺血腦組織的保護〔4〕，證實Th1/Th2細(xì)胞失衡與腦缺血/再灌注損傷相關(guān)聯(lián)。從理論上講，如果能夠調(diào)節(jié)這種免疫失衡狀態(tài)，就可以減少再灌注損傷，從而改善患者預(yù)后。

小柴胡湯原方是和解少陽而治療半表半里證的傳統(tǒng)方劑，后世醫(yī)家擴展應(yīng)用至內(nèi)傷雜病。小柴胡湯以柴胡、黃芩這一對藥為主藥，兩藥配合，升降并行，從而旋轉(zhuǎn)樞機，逆轉(zhuǎn)疾病的病理生理過程。柴胡皂苷是柴胡主要有效成分，分為a、b、d、e、f、h，其中柴胡皂苷d 藥理活性最強，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤，調(diào)解內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)等多種生物學(xué)效應(yīng)〔5〕，也表現(xiàn)出抑制NF-κB、NF-AT激活的T淋巴細(xì)胞和AP-1信號對抗增殖作用〔6,7〕。黃芩的主要活性成分黃芩苷是一種黃酮類化合物，具有抗凋亡、抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用〔8～10〕。

本研究結(jié)果表明MCAO大鼠短暫局灶性缺血/再灌注后缺血腦組織出現(xiàn)明顯的DNA單、雙鏈損傷，Th1/Th2失衡，而給予柴胡皂苷d+黃芩苷干預(yù)后，Th1/Th2失衡顯著改善，證實柴胡皂苷d及黃芩苷同時給藥可減輕腦梗死的缺血再灌注損傷，其機制可能與其維持Th1/Th2細(xì)胞平衡有關(guān)，為通過調(diào)節(jié)免疫、減少炎癥損傷治療腦梗死提供新的思路，為拓寬柴胡皂苷d聯(lián)合黃芩苷在缺血/再灌注中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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〔2016-01-19修回〕

(編輯李相軍)

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(ZL20140035)

劉占礦(1963-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

董利平(1964-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

R743.3

A

1005-9202(2016)16-3918-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.022

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科

2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心外科

3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科