胡志紅　林搏浩　王曉娜　路西明

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南　洛陽　471003)

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山茱萸果核水提取物對D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力的影響

胡志紅林搏浩王曉娜路西明

(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽471003)

目的探討山茱萸果核水提取物對D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化能力的影響。方法選擇50只昆明雄性小鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型組(10只)和提取物組(30只)。其中提取物組依據(jù)提取物劑量分為高劑量組(12 g·kg-1·d-1)、中劑量組(6 g·kg-1·d-1)、低劑量組(3 g·kg-1·d-1)，每組10只。正常對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組通過皮下連續(xù)8 w注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖制備衰老模型。采用Morris水迷宮檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，完成測試后采用黃嘌呤氧化酶法測超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)，比色法測定總抗氧化能力(T-AOC)，DTNB法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。統(tǒng)計分析所有小鼠5 d內(nèi)Morris水迷宮實驗逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)和腦組織MDA、SOD、GSH-Px、T-AOC含量。結(jié)果提取物組小鼠平均逃避潛伏期明顯低于模型組，前者穿越平臺次數(shù)高于后者(P<0.05)；但各劑量組間平均逃避潛伏期，穿越平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)。提取物組小鼠MDA水平明顯低于模型組，前者T-AOC、GSH-Px活性高于后兩者(P<0.05)；提取物組小鼠SOD活性高于模型組，但無顯著差異性(P>0.05)。結(jié)論山茱萸果核水提取物可能通過清除D-半乳糖模型小鼠產(chǎn)生過多的自由基，進而提高腦組織的抗氧化能力，從而起到延緩衰老的作用及改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，中等劑量的效果最好。

山茱萸果核水提取物；衰老；抗氧化能力

山茱萸是一種山茱萸科的落葉喬木，其果肉具有多種有效化學(xué)成分及藥效，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥治療中，具有“救脫之功，抗衰之效，較參術(shù)芪更勝”之功效〔1〕。有研究表明，山茱萸干燥成熟果核具有多種有效化學(xué)成分，其果核提取物與果肉的成分相似，具有抗腫瘤、降壓、耐疲勞、抗氧化等多種藥理作用〔2〕。但在國內(nèi)研究中，針對山茱萸果肉的藥效研究較多，而關(guān)于其果核提取物的抗氧化作用研究較少〔3〕。本研究擬探討其對小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響。

1　資料與方法

1.1材料健康雄性昆明小鼠50只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2010-0007，由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。WMT-100 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，D-半乳糖(美國Sigma公司)，山茱萸果核(河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)，超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總蛋白定量(考馬斯亮藍法)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，F(xiàn)eb-80臺式高速離心機(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)，7220型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1分組選擇50只昆明雄性小鼠，均給予適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機分為正常對照組(10只)、模型組(10只)和提取物組(30只)。其中提取物組依據(jù)提取物劑量分為高劑量組(12 g·kg-1·d-1)、中劑量組(6 g·kg-1·d-1)、低劑量組(3 g·kg-1·d-1)，每組10只。

1.2.2模型和材料制備除正常對照組外，其余各組小鼠通過皮下注射500 mg·kg-1·d-1D-半乳糖，1次/d，持續(xù)8 w，以制備衰老模型。稱取山茱萸果核500 g，經(jīng)常規(guī)清水清洗、80℃烘干、粉碎研磨后，加入2 000 ml純凈水浸泡24 h；完畢后常規(guī)80℃加熱、60目篩過濾和回收濾液及煎煮濃縮，完成后加水定容至生藥量濃度為1.0 g/ml，并放入冰箱內(nèi)貯藏；對提取組小鼠每日按對應(yīng)劑量(3、6、12 g·kg-1·d-1)灌服山茱萸果核水提取液，正常對照組和模型組小鼠灌服適量生理鹽水。

1.2.3Morris水迷宮實驗所有小鼠于模型建造完成后進行Morris水迷宮實驗。依據(jù)系統(tǒng)說明書及相關(guān)規(guī)定搭建水迷宮裝置和安裝視頻攝像系統(tǒng)。完成后設(shè)置相關(guān)參數(shù)：水溫(25±1)℃，水質(zhì)為奶粉+水混勻，池壁上以4個等距離點將水池等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限，圓形平臺放置于第Ⅲ象限中央，低于水面2 cm，完成后開始進行實驗，包括定位航行實驗和空間探索實驗。首先進行定位航行實驗，實驗期限為5 d，實驗期間各參數(shù)、環(huán)境參照物等盡量保持一致，每只小鼠在實驗開始前分別在4個象限中學(xué)習(xí)4次，每次游泳時限為60 s，系統(tǒng)自動記錄其從放入水中到爬上平臺所需的時間(即潛伏期)，對超過時限后仍未到達平臺的小鼠進行引導(dǎo)，并使其到達平臺停留10 s，此次潛伏期記為60 s。待定位航行實驗結(jié)束后進行空間探索實驗，即撤除圓形平臺后，選擇距離平臺最遠的象限中心作為入水點，觀察記錄小鼠在一定時間內(nèi)的游泳軌跡及其跨越平臺原來位置的次數(shù)。實驗期間所有數(shù)據(jù)資料均通過Morris水迷宮實驗視頻攝像系統(tǒng)進行收集。

1.2.4腦組織SOD、MDA、T-AOC、GSH-Px的測定所有小鼠于Morris水迷宮實驗結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死，于冰上迅速剝離和取出全腦，通過低溫生理鹽水(3℃～4℃)清洗腦組織，加入適量低溫生理鹽水制備10%腦組織勻漿液，通過高速離心機常規(guī)分離，取上清液12 ml分別平均置入無菌抗凝試管A(用于MDA檢測)、B(用于SOD檢測)、C(用于GSH-Px檢測)、D(用于T-AOC檢測)。向試管中滴加適量檢測試劑，采用黃嘌呤氧化酶法測SOD活性，硫代巴比妥酸法測定MDA，比色法測定T-AOC，DTNB法測定GSH-Px。其中蛋白質(zhì)測定采用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，通過分光光度計檢測其水平，所有操作均嚴(yán)格依據(jù)說明書相關(guān)規(guī)定進行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件，各組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1五組小鼠穿越平臺次數(shù)比較提取物組小鼠穿越平臺次數(shù)〔低、中、高劑量組分別為(2.14±0.98)、(2.31±1.12)、(2.08±0.45)次〕明顯高于模型組〔(1.35±0.94)次〕(P<0.05)，但三個劑量組間比較無顯著差異(P>0.05)。正常對照組為(3.78±0.59)次。

2.2五組小鼠平均逃避潛伏期比較在第1、2、3天，五組小鼠平均逃避潛伏期基本相同(P>0.05)。在第4、5天，提取物組小鼠平均逃避潛伏期明顯低于模型組(P<0.05)，且三個劑量組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3五組小鼠MDA含量，SOD、GSH-Px、T-AOC的活性比較提取物組小鼠MDA水平明顯低于模型組，T-AOC、GSH-Px活性高于模型組(P<0.05)；提取物組小鼠SOD活性高于模型組，但無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1　五組小鼠平均逃避潛伏期及MDA含量，SOD、GSH-Px、T-AOC的活性比較

與正常對照組比較：1)P<0.05，與模型組比較:2)P<0.05

3　討　論

山茱萸果核水提取物是一種收澀藥，在中醫(yī)學(xué)中具有補益肝腎、澀精固脫之功效，可有效改善機體的體質(zhì)，有利于延緩衰老〔4，5〕。有研究顯示，山茱萸果核水提取物主治心下邪氣寒熱，溫中，逐寒溫痹，去三蟲；久服輕身同兼強陰益精、安五臟、通九竅、止小便淋瀝之功;久服明目、強力長年之功效，其藥理藥效具有抗氧化、改善記憶、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用〔6，7〕。發(fā)現(xiàn)，該提取物可有效改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，有效提高小鼠腦組織的抗氧化能力，從而起到延緩衰老的作用。本研究提示，在動物實驗中，通過給予小鼠連續(xù)大劑量D-半乳糖，可有效氧化小鼠細胞，產(chǎn)生大量的自由基堆積在細胞內(nèi)，進而發(fā)生強烈的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響其正常的滲透壓，導(dǎo)致細胞正常生理活動受損引起衰老〔8，9〕。而山茱萸果核水提取物中含有多種皂苷類化合物，可能通過增強細胞內(nèi)T-AOC、GSH-Px、SOD活性和抑制MDA水平，達增強細胞抗氧能力的作用。由于T-AOC、GSH-Px、SOD屬于機體內(nèi)的主要抗氧化酶，其活性增強可有效清除機體組織中自由基代謝產(chǎn)物，抑制自由基的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少氧化反應(yīng)對生物膜的損傷，避免細胞外鈣離子內(nèi)流，線粒體內(nèi)鈣離子外流，進而降低脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA的含量，削弱線粒體內(nèi)鈣離子敏感脫氧酶的作用，保護機體細胞免受自由基氧化反應(yīng)的損傷，從而起到延緩衰老的作用。此外，可能由于山茱萸果核水提取物提高抗機體免疫器官衰老退化的作用，有效保護腦組織細胞和腦神經(jīng)細胞，使它們免受自由基氧化反應(yīng)造成細胞結(jié)構(gòu)、功能破壞；同時可能強化了它們的機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的防御能力，使細胞更快速、更有效清除氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的自由基，在雙重作用下保護了腦組織，恢復(fù)自由基氧化作用與抗氧化防御作用的動態(tài)平衡，進而有利于促進腦神經(jīng)細胞功能的修復(fù)，從而改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔10，11〕。本研究提示，小鼠腦組織可能對6 g·kg-1·d-1濃度的山茱萸果核水提取物更敏感，在此濃度下可更顯著提高腦組織的抗氧化能力，具有更良好的延緩衰老和改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

1吳慧,喻嶸,成細華,等.降糖益腎方干預(yù)胰島素信號通路改善轉(zhuǎn)基因2型糖尿病MKR鼠腎損傷的研究〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011;31(11):9-11.

2李小黎,葉翠飛,張麗,等.山茱萸環(huán)烯醚萜苷對腦缺血沙土鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011;29(2):263-6.

3丁硯兵,吳霞.壽爾智含藥血清對D-半乳糖所致AD模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)受體通道電流的影響〔J〕.新疆中醫(yī)藥,2012;30(3):5-6.

4陳克芳,潘愛珍,侯祥平.山茱萸總苷對急性缺氧乳鼠心肌細胞凋亡通路的影響〔J〕.中藥藥理與臨床,2014;30(6):54-7.

5陸艷,張雨霏,楊光明,等.山茱萸炮制過程中的紅外光譜與美拉德反應(yīng)〔J〕.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016;32(1):79-82.

6陳克芳,李建軍,潘愛珍,等.山茱萸總苷干預(yù)急性缺氧乳鼠心肌細胞凋亡線粒體通路的研究〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2015;13(8):970-2.

7郝帥,于飛,楊博,等.D-半乳糖對仔鼠脂質(zhì)過氧化、聽力和耳蝸毛細胞的損傷及其機制〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2012;38(3):419-22.

8顧翠英,韓志芬,夏花英,等.金雀異黃素對D-半乳糖損傷的乳鼠皮膚成纖維細胞的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2012;32(24):5461-4.

9梁華,孫燕佩,朱明雪,等.D-半乳糖所致衰老模型鼠的免疫功能變化〔J〕.中國臨床保健雜志,2012;15(3):322-3.

10劉豐彬,沈梅.運動訓(xùn)練和補肽抗大鼠骨骼肌衰老機制的初步研究〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2014;30(2):142-6.

11Hayashi T,Tachibana S,Nakao K,etal.Diaphragmatic endometriosis-associated pneumothorax triggered by abortion;report of a case〔J〕.Kyobu Geka,2011;64(13):1201-3.

〔2015-12-15修回〕

(編輯曲莉)

Effect of water extract of fructus corni officinalis core on the antioxidant capacity of aged mice model induced by D-galactose

HU Zhi-Hong,LIN Bo-Hao,WANG Xiao-Na,et al.

Medical College of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,Henan,China

ObjectiveTo discuss the effect of water extract of fructus corni officinalis core on the antioxidant capacity of aged mice model induced by D-galactose.Methods50 male Kunming mice were randomly divided into normal control,model and high(12 g/kg),middle(6 g/kg),low(3 g/kg) dose extract groups.Morris water maze test was used to test the abilities of learning and memory.The xanthine oxidase method was used to measure the activity of superoxide enzyme(SOD),glucosinolates barbituric acid method was used to determine the activity of malondialdehyde(MDA),colorimetric method was used to determine the activity of total antioxidant capacity(T-AOC),DTNB method was used to determine the activity of glutathione peroxidase(GSH-Px).ResultsThe average escape latencies in extract groups were significantly lower than that of model group,the times through the platform were higher than that of model group(P<0.05).The MDA levels in extract groups were significantly lower than that of model group,the levels of T-AOC,GSH-PX activity were higher(P<0.05).The SOD activity of extract groups were higher than that in model group,but there were no significant differences(P>0.05).ConclusionsThe water extract of fructus corni officinalis core could improve the antioxidant abilities of brain tissue and improve the abilities of learning and memory in aging mice.

Water extract of fructus corni officinalis;Aged;Antioxidant capacity

河南省科技攻關(guān)計劃項目(082102310031)

胡志紅(1967-)，女，碩士，副教授，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

R28

A

1005-9202(2016)16-3906-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.016