鄭　潔　寇久社　王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西　西安　712046)

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青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型血清及滑液內(nèi)脂素及抵抗素的影響

鄭潔寇久社1王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，陜西西安712046)

目的觀(guān)察青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型血清及滑液中脂肪因子內(nèi)脂素及抵抗素含量的影響。方法38只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。正常組不予任何處理，模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組通過(guò)木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射法誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎模型后，分別用生理鹽水、透明質(zhì)酸鈉和青藤堿干預(yù)，5 w后檢測(cè)并比較各組血清及滑液中內(nèi)脂素及抵抗素含量。結(jié)果各組間血清內(nèi)脂素含量均無(wú)明顯差異(P>0.05)；模型組滑液內(nèi)脂素含量較其他各組明顯升高(P<0.05)，青藤堿組較透明質(zhì)酸鈉組低(P<0.05)。模型組血清及滑液中抵抗素含量較其他各組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組血清及滑液中抵抗素含量與透明質(zhì)酸鈉組比較無(wú)顯著差異(P<0.05)。 結(jié)論青藤堿膝關(guān)節(jié)腔注射可降低兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型滑液內(nèi)脂素水平及血清、滑液中抵抗素水平。

青藤堿；關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射；骨關(guān)節(jié)炎；內(nèi)脂素；抵抗素

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是由多因素造成的關(guān)節(jié)退行性疾病，以關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨變化、骨贅形成以及滑膜炎癥為主要特征。炎癥在OA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了不可忽視的作用，炎癥可能是OA的原發(fā)事件，也可能是關(guān)節(jié)軟骨生化變化的繼發(fā)事件〔1〕。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞因子除參與調(diào)節(jié)糖脂代謝，在炎癥過(guò)程以及OA發(fā)病中均發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用〔2，3〕。青藤堿是從傳統(tǒng)治療風(fēng)濕性疾病中藥清風(fēng)藤中提取的一種生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用〔4〕。青藤堿在骨關(guān)節(jié)病中的臨床及實(shí)驗(yàn)研究目前仍主要集中在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而應(yīng)用于OA的研究非常少。本實(shí)驗(yàn)擬探討青藤堿治療膝骨關(guān)節(jié)炎的部分作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組新西蘭大白兔38只，雌雄各半，體重1.8～2.2 kg，由西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(陜)2008-008。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。其中正常組8只，其余各組均為10只。

1.2試劑與儀器內(nèi)脂素及抵抗素試劑盒(北京諾博萊科技有限公司)，正清風(fēng)痛寧注射液(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)1304402-003，規(guī)格2 ml∶50 mg)，玻璃酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)130308011，規(guī)格2 ml∶20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，貨號(hào)107147，活力6000 USP-U/mg)，Bio-Tec ELX808型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tec公司)，HH·W21·420型電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，KDC-40型低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備造模方法采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射法，分別于實(shí)驗(yàn)的第1、4、7天對(duì)造模組兔進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射，首次注射4 w后兔右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、跛行，表明造模成功。

1.3.2木瓜蛋白酶溶液配制將木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 ml)的濃度溶解于生理鹽水中，裝入50 ml 無(wú)菌瓶中并置于 0～4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3注射方法兔右膝關(guān)節(jié)備皮、75%乙醇消毒后，用左手從下方和兩旁將右側(cè)膝關(guān)節(jié)輕度屈曲位固定，右手持1 ml注射器在髕韌帶附著點(diǎn)外上方約 0.5 cm 處向髁間窩方向進(jìn)針，當(dāng)出現(xiàn)落空感時(shí)表明已進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，注入0.5 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液。

1.3.4干預(yù)措施根據(jù)成人用藥劑量(透明質(zhì)酸鈉和青藤堿均為2 ml/次)按Meeh-Rubner公式計(jì)算人兔等效劑量。除正常組外，對(duì)各組動(dòng)物造模側(cè)膝關(guān)節(jié)行關(guān)節(jié)腔注射，青藤堿組膝關(guān)節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 ml(5 mg)，1次/3 d，10次1個(gè)療程，共給藥10次；透明質(zhì)酸鈉組膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉注射液0.2 ml，1次/6 d，5次1個(gè)療程，共5次；模型組膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.2 ml，注射次數(shù)同青藤堿組。共干預(yù)30 d。

1.3.5標(biāo)本采集①血清采集：干預(yù)結(jié)束后，耳中動(dòng)脈取血5 ml，4 000 r/min離心10 min，分離血清后-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。②滑液采集：干預(yù)結(jié)束后，生理鹽水沖洗法收集滑液。于兔的右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水注射液1 ml(注射方法同前)，充分活動(dòng)膝關(guān)節(jié)使生理鹽水與關(guān)節(jié)滑液充分混合，再抽取關(guān)節(jié)腔生理鹽水沖洗液0.6～1 ml至EP管，4 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.3.6指標(biāo)檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定血清和滑液中內(nèi)脂素及抵抗素的含量。操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1肉眼觀(guān)察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組、透明質(zhì)酸鈉組及青藤堿組兔各死亡1只，各組實(shí)驗(yàn)兔最終為正常組8只，模型組、透明質(zhì)酸鈉組及青藤堿組各9只。正常組：滑膜未見(jiàn)明顯改變，關(guān)節(jié)軟骨表面呈淺藍(lán)白色，光滑而有光澤，無(wú)糜爛。模型組：滑膜充血腫脹，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙、肥厚，色澤變暗，伴有裂紋、糜爛，部分軟骨下骨質(zhì)暴露，滑液量多，色黃，質(zhì)稠。透明質(zhì)酸鈉組：滑膜輕度腫脹，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑，部分可見(jiàn)裂紋，尚未見(jiàn)軟骨下骨質(zhì)暴露。青藤堿組：滑膜輕度腫脹，關(guān)節(jié)軟骨略粗糙，糜爛程度較模型組輕。

2.2血清及滑液內(nèi)脂素含量測(cè)定兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型血清中內(nèi)脂素含量無(wú)明顯變化，正常組與其他各組血清內(nèi)脂素含量比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)。模型組滑液內(nèi)脂素含量較正常組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組滑液內(nèi)脂素含量與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，與透明質(zhì)酸鈉組比較呈顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組兔血清及滑液內(nèi)脂素含量比較±s,μg/L)

與模型組比較:1)P<0.05；與透明質(zhì)酸鈉組比較比較:2)P<0.05

2.3血清及滑液抵抗素含量測(cè)定模型組血清及滑液中抵抗素含量較正常組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組血清及滑液中抵抗素含量與正常組比較有顯著差異(P<0.05)，與透明質(zhì)酸鈉組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2　各組兔血清及滑液抵抗素含量比較±s,μg/L)

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3　討　論

脂肪細(xì)胞因子是一類(lèi)由白色脂肪組織分泌的內(nèi)源性活性多肽，在OA病理生理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，既可作為前炎(或促炎)細(xì)胞因子參與OA炎癥過(guò)程；也可獨(dú)立地或與一些炎性因子協(xié)同作用，通過(guò)軟骨基質(zhì)降解酶加速OA后期軟骨蛻變過(guò)程〔3〕。內(nèi)脂素最早發(fā)現(xiàn)于肝臟、骨髓和肌肉，后來(lái)發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟脂肪組織也可分泌內(nèi)脂素。OA患者髕下脂肪墊和滑液中內(nèi)脂素含量均顯著增高〔5，6〕，且滑液中內(nèi)脂素水平與軟骨降解產(chǎn)物Ⅱ型膠原和蛋白聚糖含量呈正相關(guān)，表明內(nèi)脂素參與OA軟骨基質(zhì)的降解過(guò)程〔6〕。抵抗素在多種炎癥性疾病的發(fā)病中起到了重要的調(diào)控作用。創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎患者血清和滑液抵抗素的含量均明顯提高〔7〕。經(jīng)抵抗素誘導(dǎo)后，人軟骨細(xì)胞中多種趨化因子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)均上調(diào)，證實(shí)抵抗素可能作為致炎因素參與了OA炎癥反應(yīng)，并加速了軟骨的降解過(guò)程〔8〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型滑液中內(nèi)脂素和血清及滑液抵抗素水平均顯著提高，進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)脂素和抵抗素等脂肪因子參與OA病理過(guò)程。臨床研究表明，青藤堿可緩解OA患者膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及晨僵等癥狀，顯著改善膝關(guān)節(jié)功能障礙〔9，10〕。青藤堿膝關(guān)節(jié)腔注射后，關(guān)節(jié)腔滑液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量顯著下降〔11～13〕，提示青藤堿對(duì)OA軟骨具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗炎作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青藤堿關(guān)節(jié)腔注射抗OA作用可能與影響內(nèi)脂素和抵抗素等脂肪因子水平密切相關(guān)。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

陜西省中醫(yī)康復(fù)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(陜中醫(yī)藥發(fā)〔2011〕46號(hào))；陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(14JK1209)

鄭潔(1978-)，女，副教授，博士，主要從事骨關(guān)節(jié)及骨代謝性疾病的中醫(yī)康復(fù)研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3904-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.015

1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院