劉　冰　臧　琳　金　嵩　朱天信　劉玉翠　楊　陽　姜　暢　齊　玲　于洪泉

(吉林醫(yī)藥學院附屬465醫(yī)院，吉林　吉林　132013)

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黃連素抗膠質瘤的作用機制

劉冰臧琳1金嵩1朱天信1劉玉翠1楊陽1姜暢1齊玲1于洪泉2

(吉林醫(yī)藥學院附屬465醫(yī)院，吉林吉林132013)

目的探討黃連素對大鼠惡性腦膠質瘤C6細胞生長的作用。方法培養(yǎng)惡性腦膠質瘤C6細胞，MTT法檢測黃連素對C6細胞生長增殖的抑制作用，并且觀察藥物對細胞生長的影響。結果12.5、25、50、100 μmol/L黃連素均可以明顯抑制C6細胞的生長，倒置顯微鏡下觀察到藥物作用后細胞密度明顯降低。結論黃連素能明顯抑制腦膠質瘤細胞的生長增殖。

黃連素；惡性膠質瘤

黃連素(也稱為鹽酸小檗堿)是一種常見的異喹啉類生物堿，對多種革蘭陽性菌和陰性菌的生長均有抑制作用，臨床上主要用于清熱解毒和治療腸道感染。此外，臨床觀察還發(fā)現(xiàn)：黃連素還具有抗心律失常、改善心力衰竭、降血壓、降血脂、降血糖和治療消化性潰瘍等作用。近年發(fā)現(xiàn)，其在腫瘤治療中也發(fā)揮一定的作用。本實驗擬研究黃連素對腦膠質瘤細胞生長的影響及作用。

1　材料與方法

1.1細胞株與試劑C6細胞由吉林醫(yī)院學院科研實驗室提供；新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基購自于美國Hyclone公司，0.25%胰酶和青鏈霉素購于美國Gibco公司，二甲基亞楓(DMSO)購于美國Thermo公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于美國Sigma公司。50 mmol/L黃連素原液用DMSO配制后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)復蘇C6細胞，用10% 1640培養(yǎng)基重懸細胞，混勻后將細胞置于培養(yǎng)板中，置入孵箱培養(yǎng)，隔日換液，1∶3傳代。

1.2.2MTT分析將生長狀態(tài)良好的C6細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用10%1640培養(yǎng)基重懸制成8×104個/ml密度的細胞懸液，每孔100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日加入12.5、25、50和100 μmol/L黃連素繼續(xù)培養(yǎng)，0濃度作為對照組，每組5個復孔。黃連素作用48和72 h，實驗終止前4 h每孔加入20 μl MTT孵育，甩板后每孔加入150 μl DMSO均勻振蕩10 min，全自動酶標儀波長490 nm處測定每組各孔的吸光度值。

1.2.3倒置顯微鏡觀察取6孔培養(yǎng)板，以每孔1×105個細胞密度將細胞均勻接種于6孔板中，加入12.5 μmol/L黃連素培養(yǎng)，作用72 h，設0濃度為空白對照組，實驗結束后將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2　結　果

2.1黃連素對膠質瘤細胞生長的影響12.5、25、50和100 μmol/L的黃連素在作用C6細胞48和72 h均可以抑制C6細胞的生長，與對照組比較，48 h時25、50 μmol/L黃連素組有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；72 h時，12.5、25、50和100 μmol/L黃連素組均有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；且隨著時間的延長，對C6細胞增殖的抑制作用越明顯。見表1。

表1　不同濃度黃連素對C6細胞增殖的影響±s，n=5，A值)

與對照組比較：1)P<0.01

2.2黃連素對C6細胞生長形態(tài)的影響空白對照組(0 μmol/L)：在培養(yǎng)瓶內(nèi)大量細胞貼壁生長，呈長梭形，分布有大量的呈圓球狀生長活躍的腫瘤細胞；黃連素組(12.5 μmol/L)：貼壁生長細胞的密度明顯降低，有的細胞明顯皺縮，還可見到部分細胞碎片。見圖1。

圖1　黃連素對C6細胞生長形態(tài)的影響

3　討　論

腦膠質瘤是發(fā)病率、病死率最高的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤〔1〕，約占顱內(nèi)腫瘤的44.60%〔2〕。按照病理惡性程度分為四級，其中Ⅲ～Ⅳ級為惡性膠質瘤，腫瘤的生長速度快、患者的病程短，并且生長時腫瘤與正常腦組織無明顯的界限，這就造成惡性膠質瘤的治療較其他腫瘤的治療更困難。目前，腦膠質瘤的治療主要采用手術及術后放、化療的方式，術后生存率低。調查顯示，腦膠質瘤患者放、化療結合的平均時間是51～73 w，而單獨使用放射治療的中位時間是35 w〔3〕。美國的兩項大型研究表明，單純放療患者18個月生存率為38.4%，而放化療結合者18個月的生存率為44.9%〔4〕。

黃連素具有清熱解毒、抗炎殺菌的作用，一直以來廣泛應用于胃腸道感染的治療。本實驗研究了不同濃度的黃連素對腦膠質瘤生長的抑制作用。12.5、25、50和100 μmol/L黃連素在作用48 h和72 h，均可以明顯地抑制膠質瘤細胞的生長，作用呈明顯的時間效應。黃連素作用后細胞的生長明顯受影響，鏡下可以觀察到C6膠質瘤細胞密度明顯地降低，細胞出現(xiàn)明顯地皺縮，有的細胞出現(xiàn)破裂死亡〔5～8〕。

綜上所述，黃連素可以促使膠質瘤細胞死亡而抑制腫瘤細胞的體外生長，但其機制還有待在今后的實驗中深入研究。

1師蔚，郭振宇.腦膠質瘤發(fā)病機制、診斷與治療的研究進展〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學雜志，2007；6(9)：869-71.

2張紀.深入開展膠質瘤綜合治療及其基礎研究〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2003；19(1)：1-2.

3Wakimoto H，Kesari S，F(xiàn)arrell CJ，etal.Human gliblastoma-derived cancer stem cells：establishment of invasive glioma models and treatment with encolytic herpes simplex virus vectors〔J〕.Cancer Res，2009；69(8)：39-43.

4Deangelis LM.Anaplastic glioma：how to prognosticate outcome and choose a treatment strategy〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(35)：5861-2.

5張茜，肖新華，王彤，等.黃連素降糖調脂機制的研究〔J〕.中國實驗動物學報，2011；19(1)：29-33.

6楊萍.黃連素臨床應用及研究的新進展〔J〕.天津藥學，2011；23(3)：69-72.

7鄭凌云，周祖玉，陶大昌，等.黃連素對缺血再灌注心肌細胞損傷的保護作用〔J〕.四川大學學報(醫(yī)學版)，2003；34(3)：452-4.

8臺衛(wèi)平，田耕，黃業(yè)斌，等.鹽酸小檗堿抑制結腸癌細胞環(huán)氧化酶-2/鈣離子途徑〔J〕.中國藥理學通報，2005；21(8)：950-3.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

吉林省科技廳國際合作項目(No.20140414049GH)；吉林省衛(wèi)生廳項目(No.2014Z104)；吉林省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(No.2014)

齊玲(1974-)，女，副教授，主要從事腦腫瘤研究。

于洪泉(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦腫瘤研究。

劉冰(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事中藥研究工作。

R739.1

A

1005-9202(2016)16-3900-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.013

1吉林醫(yī)藥學院病理教研室2吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)外科