李　輝　陳俊宇　楊　擎　張慧媛　林嘉楠　劉英娜　黃連弟　黃　迪　李俊瑋　趙本正　李　娜

(吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林　長春　130012)

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鹿角膠對腦缺血大鼠腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制

李輝陳俊宇1楊擎2張慧媛2林嘉楠2劉英娜2黃連弟1黃迪1李俊瑋1趙本正1李娜2

(吉林省前衛(wèi)醫(yī)院，吉林長春130012)

目的觀察鹿角膠對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組。線栓法制備大鼠腦缺血模型。采用行為學(xué)評分評價大鼠腦缺血程度，大腦TTC染色觀察梗死面積，HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化，比色法檢測大鼠血清中相關(guān)過氧化物水平。結(jié)果與模型組比較，鹿角膠給藥組腦缺血程度明顯減輕，梗死面積減小，神經(jīng)元胞體腫脹減輕，乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平下降(P<0.05)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)的活力增強(qiáng)。結(jié)論局部腦缺血導(dǎo)致腦梗死過程中，鹿角膠可通過清除腦組織缺血損傷過程中產(chǎn)生的氧自由基，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)腦組織的目的。

腦缺血；鹿角膠；氧化損傷

腦血管疾病中，缺血性腦血管病占80%以上，大腦中動脈閉塞(MCAO)占血管閉塞的43%。因此，針對MCAO的研究顯得尤為重要〔1〕。腦血管發(fā)生部分或者全部阻塞后，導(dǎo)致相應(yīng)供應(yīng)區(qū)的腦組織供血不足，腦細(xì)胞缺血缺氧產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷〔2〕。鹿角膠由鹿科動物梅花鹿(Cevus Nippon Temininck)或馬鹿(C.ela Phus L)的角煎熬而成，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱“白膠”，在《本草逢原》中稱鹿膠，現(xiàn)稱鹿角膠。中醫(yī)醫(yī)書中記載鹿角膠針對消腫、益腎、治瘡瘍腫毒、痕血作痛、虛勞內(nèi)傷、腰脊疼痛等具有很好的療效〔3〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)報道，鹿角膠成分多樣，包含膠質(zhì)25%、磷酸鈣50%～60%以及少量雌酮，另含有多種氨基酸，包括色氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸等，還含有硫酸軟骨素A、激素、膽堿樣物質(zhì)及多種微量元素〔4〕。鹿角膠所含物質(zhì)的多樣性決定了其對人體具有廣泛的藥用價值，據(jù)文獻(xiàn)報道，中醫(yī)涉及鹿茸的方劑有852個，統(tǒng)計相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果顯示，其主要功效包括壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、駐顏悅色、益氣養(yǎng)神等〔5〕，而鹿角膠對腦缺血再灌注損傷的作用仍需進(jìn)一步研究。

1　材料與方法

1.1主要試劑鹿角膠(河南輔仁堂制藥有限公司，批注文號：國藥準(zhǔn)字Z41021998)；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)活力檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2動物分組及模型制備將40只大鼠分為：①空白組，通過灌胃法給等量的鹽水；②模型組，用線栓法阻斷左側(cè)頸總動脈，制備大鼠MCAO腦缺血模型；③鹿角膠低劑量組，造模前1 w灌胃給予大鼠鹿角膠溶液0.3 g/kg，1次/d，1次/d，之后再進(jìn)行造模，簡稱低劑量組；④鹿角膠高劑量組，造模前1 w灌胃給予大鼠鹿角膠溶液0.6 g/kg，之后再進(jìn)行造模，簡稱高劑量組。

參照文獻(xiàn)〔6〕方法制備大鼠局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于手術(shù)臺上，切開右側(cè)頸部皮膚分離并結(jié)扎頸外動脈，自右側(cè)頸總動脈剪口將3 cm的尼龍線(末端燒成圓形，直徑約0.25 mm)自切口插入，進(jìn)入頸內(nèi)動脈約18 mm直至有輕微阻力為止，固定尼龍線并縫合皮膚。術(shù)后 37℃保溫，待動物蘇醒后通過神經(jīng)功能學(xué)評分判定模型是否制備成功。

神經(jīng)功能學(xué)評分的標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；2分，前肢屈曲對側(cè)抵抗推力下降；3分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙。評分在 2 分以上為造模成功。

1.3形態(tài)學(xué)觀察模型制備成功后，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，吸入麻醉處死動物。大腦TTC染色觀察梗死面積。10%甲醛固定，石蠟包埋，病理切片HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4血清學(xué)檢測取血液3 000 r/min離心10 min，收集血清。檢測血清中LDH和MDA含量，T-SOD活力、GSH-PX活力和CAT活力。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1行為學(xué)評分空白組大鼠精神正常，四肢及行走步態(tài)均正常，評分為0。模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，提尾對側(cè)前肢不能伸展，行走向?qū)?cè)傾倒或者不同程度旋轉(zhuǎn)，綜合評分為(3.5±0.4)分，大鼠模型制備成功。低劑量組和高劑量組的神經(jīng)學(xué)評分分別為(2.8±0.3)分和(2.1±0.3)分，與模型組相比均明顯降低(P<0.05)。

2.2腦梗死面積空白組腦組織無梗死區(qū)。模型組梗死區(qū)域占整個腦組織的16.4%±4.5%；低劑量組梗死區(qū)約占整個腦組織的12.1%±3.7%；而高劑量組梗死區(qū)明顯減小，約占整個腦組織的8.6%±2.3%。

2.3HE染色結(jié)果空白組海馬層次、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊、緊密；神經(jīng)元形態(tài)完整，胞核染色清晰，核圓形或橢圓形、核仁明顯。模型組海馬結(jié)構(gòu)層次紊亂，細(xì)胞排列稀疏；細(xì)胞周圍間隙增寬；部分神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核界限模糊，核固不規(guī)則形，核仁不明顯，部分細(xì)胞核淡染及空泡化。灌胃給鹿角膠的兩組顯示海馬區(qū)細(xì)胞排列較整齊，神經(jīng)元胞體腫脹減輕，病理改變均有不同程度的改善。見圖1。

2.4血清酶學(xué)檢測結(jié)果與空白組比較，模型組中LDH和MDA含量明顯升高(P<0.05)，鹿角膠給藥組的LDH和MDA含量均低于模型組(P<0.05)，其中以高劑量組最明顯(P<0.05)。與空白組比較，模型組中CAT、T-SOD以及GSH-PX活力明顯較低(P<0.01)，與模型組相比，低劑量組和高劑量組的CAT、T-SOD及GSH-PX活力明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

圖1　各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果

組別LDH(U/L)CAT(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-PX活性T-SOD(U/mgprot)空白組1134.02±169.542.15±0.114.90±0.12556.08±23.4457.06±2.53模型組3976.56±169.561)1.51±0.241)10.17±0.241)317.97±9.631)51.82±1.711)低劑量組1544.90±70.152)2.53±0.072)3.20±0.562)721.83±8.82)77.23±0.532)高劑量組1639.84±162.123)3.54±0.853)4.96±1.203)767.10±14.373)78.53±0.953)

與空白組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

3　討　論

本研究通過線栓法制備腦缺血大鼠模型，行為學(xué)評分結(jié)果顯示模型組評分顯著高于空白組，說明模型制備成功，而鹿角膠給藥組的評分明顯低于模型組，提示鹿角膠對腦缺血具有一定的保護(hù)作用。腦組織TTC染色和HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，鹿角膠給藥組腦組織梗死面積減小，細(xì)胞排列整齊，病理改變減輕，進(jìn)一步證實鹿角膠對腦缺血的保護(hù)作用。

腦缺血發(fā)生后，氧自由基貫穿于腦組織損傷的多個環(huán)節(jié)，患者發(fā)生腦缺血后也使用相應(yīng)的清除氧自由基的藥物〔8〕。很多中草藥對腦缺血具有良好的治療作用，如芹菜素、葛根素、甘草酸二銨和梓醇等〔9～12〕。研究表明，中藥對腦缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制主要為清除自由基，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載及興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，抑制細(xì)胞凋亡，阻止炎性反應(yīng)等〔13,14〕。

LDH是一種糖酵解酶，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)組織發(fā)生病變和損傷時，細(xì)胞破裂，細(xì)胞質(zhì)中的LDH釋放入血，血液中LDH升高，通過檢測血清中LDH的含量可評價組織的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，模型組LDH含量高于空白組，低劑量、高劑量組LDH含量均低于模型組，表明大鼠發(fā)生腦缺血過程中鹿角膠可以降低腦組織損傷的程度。

腦組織缺血缺氧后通過酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化后，使MDA等脂質(zhì)過氧化物水平上升，所以血清中MDA可以間接反映組織細(xì)胞損傷程度。本研究結(jié)果提示大腦發(fā)生缺血缺氧時，鹿角膠在一定程度可以通過抗脂質(zhì)過氧化保護(hù)腦組織。SOD、GSH-PX和CAT水平的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本文結(jié)果顯示，模型組抗氧化酶活性明顯降低，而鹿角膠處理組大鼠血清中抗氧化酶活性明顯高于模型組，提示鹿角膠對腦組織保護(hù)作用的機(jī)制之一是通過抗氧化途徑。

綜上，鹿角膠具有明顯的腦組織保護(hù)作用，其機(jī)制之一是降低由于腦缺血產(chǎn)生的氧自由基，提高氧自由基清除率，從而減輕腦組織損傷。鹿角膠是否還通過其他途徑對腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用仍需進(jìn)一步研究。

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3彭如枝.鹿角與鹿角膠〔J〕.明膠科學(xué)與技術(shù)，1994；14(4)：195-8.

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9劉嬋，涂豐霞，陳翔.芹菜素對大鼠急性腦損傷的保護(hù)作用〔J〕.中草藥，2009；40(10)：1598-602.

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〔2015-12-15修回〕

(編輯李相軍)

吉林省教育廳資助課題〔吉教科合字(2014)第98號〕

李娜(1978-)，女，副教授，博士，主要從事中藥藥理研究。

李輝(1978-)，男，醫(yī)師，主要從事中藥藥理研究。

R282174

A

1005-9202(2016)16-3895-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.011

1吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系

2長春中醫(yī)藥大學(xué)