李晨光　劉　菲　張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦外科，遼寧　錦州　121001)

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鈣敏感受體對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)胱硫醚-γ-裂解酶表達(dá)的調(diào)控

李晨光劉菲張鳳香

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦外科，遼寧錦州121001)

目的研究鈣敏感受體(CaR)是否通過(guò)增強(qiáng)鈣調(diào)蛋白(CaM)的表達(dá)提高胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的活性，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。方法Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中CSE、PI3K和p-AKT的表達(dá)；敏感硫電極法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中H2S含量的變化；油紅O染色檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)含量；HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，GdCl3組明顯增強(qiáng)CSE的表達(dá)，而PI3K和p-AKT的表達(dá)被明顯抑制；CaM抑制劑U73122組和GdCl3+U73122組PI3K和p-AKT的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而CSE的表達(dá)被明顯抑制。敏感硫電極法檢測(cè)H2S的相對(duì)含量結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，GdCl3組作用泡沫細(xì)胞48 h后H2S的相對(duì)含量明顯增加；而U73122組和GdCl3+U73122組H2S的相對(duì)含量明顯降低。油紅O染色檢測(cè)和HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，GdCl3組作用泡沫細(xì)胞48 h后，巨噬細(xì)胞泡沫化程度明顯降低，而U73122組和GdCl3+U73122組巨噬細(xì)胞泡沫化程度均明顯增加。結(jié)論CaR可以通過(guò)增強(qiáng)CaM的表達(dá)激活細(xì)胞內(nèi)CSE的活性，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

鈣敏感受體；鈣調(diào)蛋白；胱硫醚-γ-裂解酶

研究顯示〔1〕，硫化氫(H2S)/胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)對(duì)心血管疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化)的發(fā)展具有拮抗作用，可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制新生內(nèi)膜形成、抑制泡沫細(xì)胞形成等〔2，3〕。但CSE/H2S體系抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的具體機(jī)制尚不十分清楚。鈣調(diào)蛋白(CaM)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的重要受體，研究表明〔4〕，細(xì)胞內(nèi)鈣增加可以活化CaM活性，然后通過(guò)活化的Ca2+/CaM通路對(duì)CSE的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控H2S的生成，最終影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。研究已經(jīng)證實(shí)〔5〕，鈣敏感受體(CaR)在巨噬細(xì)胞內(nèi)不僅存在表達(dá)，而且還能夠通過(guò)G蛋白-PLC-IP3通路引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+。Kamano等〔6〕報(bào)道，提高Ca2+可增加外周血中單核細(xì)胞的化學(xué)趨向性。此外，細(xì)胞內(nèi)鈣的增加可以活化CaM的活性，然后通過(guò)活化的Ca2+/CaM通路抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

我們前期研究證明，CaR可以通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞內(nèi)CSE的表達(dá)促進(jìn)H2S的分泌，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本文主要探討CaR是否能通過(guò)CaM促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)CSE的表達(dá)，從而促進(jìn)H2S的分泌，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑CaM抑制劑U73122購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；THP-1人單核巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；CaR激動(dòng)劑GdCl3購(gòu)自上海生物工程有限公司；人氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)購(gòu)于北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法①細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分析：THP-1人單核巨噬細(xì)胞置于5% CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濃度控制在106/ml，每2 d換液一次，細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min 后傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每隔3～5 d傳代一次，取傳代后巨噬細(xì)胞，加入終濃度為80 mg/L的ox-LDL，共同孵育48 h，即得泡沫細(xì)胞模型。將誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組；GdCl3(10 μg/ml)組；GdCl3+U73122(30 μg/ml)組；U73122(30 μg/ml)組，分別培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。②H2S的檢測(cè)：取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞上清液，采用敏感硫電極法進(jìn)行檢測(cè)，敏感硫電極(Pag/S1上海雷磁)。③細(xì)胞油紅O染色：各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后，經(jīng)過(guò)PBS反復(fù)沖洗，10%甲醛固定，新過(guò)濾的油紅O染色細(xì)胞10 min，蘇木精明礬染液染色5 min，封片封固。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率。④HPLC分析：收集細(xì)胞，棄上清，NaCl 500 μl重懸細(xì)胞，離心機(jī)離心，蛋白定量檢測(cè)。經(jīng)過(guò)己烷混合烘干后沉淀。再經(jīng)異丙醇、乙腈溶解，離心后收集上清液，測(cè)定膽固醇酯(CE)、游離膽固醇(FC)和總膽固醇(TC)的含量。⑤Western印跡檢測(cè)：收集細(xì)胞，提取總蛋白，SDS電泳分離，分別加入1∶500兔抗鼠CaR抗體、1∶1 000鼠抗人p-AKT單克隆抗體、1∶500兔抗人PI3K多克隆抗體和1∶1 000兔抗鼠CSE單克隆抗體，反復(fù)漂洗后加發(fā)光劑，感光、顯影、定影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件，組間比較采用ANOVA方法分析。

2　結(jié)　果

2.1CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞中CSE表達(dá)的影響與空白對(duì)照組(0.803±0.021)比較，GdCl3組(1.741±0.056)明顯增強(qiáng)CSE的表達(dá)；而U73122組(0.635±0.012)和GdCl3+U73122組(0.607±0.011)CSE 的表達(dá)均明顯降低。見(jiàn)圖1。

2.2CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)H2S分泌的影響與空白對(duì)照組(13.12±1.04)比較，GdCl3組H2S的相對(duì)含量(21.78±1.82)明顯增加；U73122組(6.02±0.73)和GdCl3+U73122組(6.57±0.89)H2S的相對(duì)含量明顯降低(P<0.05)。

2.3CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化程度的影響GdCl3組、U73122組和GdCl3+U73122組作用泡沫細(xì)胞48 h后，細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率分別為(17.14±3.30)%、(82.54±1.63)%和(84.15±2.17)%，與空白對(duì)照組〔(58.33±2.86)%〕比較，GdCl3組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)；而U73122組、GdCl3+U73122組細(xì)胞油紅O染色陽(yáng)性率均明顯增加(P<0.05)。

2.4CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中脂質(zhì)蓄積的影響與空白對(duì)照組比較，GdCl3組細(xì)胞內(nèi)CE、FC和TC含量均明顯下降，而U73122組、GdCl3+U73122組細(xì)胞內(nèi)CE、FC和TC均明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞PI3K及p-Akt蛋白表達(dá)的影響如圖3所示，與空白對(duì)照組比較，GdCl3組能明顯抑制PI3K和p-AKT的表達(dá)；而U73122組和GdCl3+U73122組PI3K和p-AKT的表達(dá)均被明顯增強(qiáng)(P<0.05)。

圖1　Western印跡檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞中CSE的表達(dá)

與空白對(duì)照組相比：1)P<0.05；下圖同圖2　HPLC檢測(cè)CaR激動(dòng)劑聯(lián)合CaM抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程中脂質(zhì)蓄積的影響

圖3　Western印跡檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)情況

3　討　論

CaM是一種廣泛存在于生物體的Ca2+結(jié)合蛋白，對(duì)細(xì)胞功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+升高時(shí)，Ca2+和CaM結(jié)合，形成活性CaM，其構(gòu)象發(fā)生改變，再與靶蛋白或靶酶結(jié)合，引起CaM進(jìn)一步變構(gòu)及靶蛋白變構(gòu)，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到刺激引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加時(shí)，CaM可與Ca2+結(jié)合，形成有活性的CaM，然后通過(guò)活化的Ca2+/CaM通路對(duì)CSE 的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)H2S的生成，最終抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

CaR在人體分布廣泛，主要分布在甲狀旁腺、腎臟、胃腸道、骨組織以及其他細(xì)胞等。研究已經(jīng)證實(shí)〔8〕，在巨噬細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的 CaR可以通過(guò)增強(qiáng)CaM 的活性抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CaR可以通過(guò)增強(qiáng)CSE的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)H2S的分泌，但該作用的完成是否與CaM的表達(dá)變化有關(guān)尚不得而知。

本研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)CaR的表達(dá)可以明顯增強(qiáng)CSE的表達(dá)，但當(dāng)CaM的表達(dá)被抑制時(shí)CaR增強(qiáng) CSE表達(dá)的作用被明顯降低，說(shuō)明CaR可能是通過(guò)增強(qiáng)CaM的表達(dá)提高CSE的活性。本研究通過(guò)敏感硫電極法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的CaR可以明顯促進(jìn)H2S的分泌，但當(dāng)阻斷CaM的表達(dá)時(shí)CaR促進(jìn) H2S分泌的這種作用均被明顯抑制。又通過(guò)油紅O染色和HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，增加CaR的表達(dá)可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化程度，但當(dāng)CaM的表達(dá)被阻斷時(shí)CaR抑制巨噬細(xì)胞向泡沫化細(xì)胞轉(zhuǎn)變的能力被明顯降低 。研究已經(jīng)證實(shí)〔9〕，CaM通過(guò)增強(qiáng)CSE 的活性促進(jìn)H2S的生成，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CaR可以通過(guò)增強(qiáng)CaM的表達(dá)提高CSE的活性。因此，我們認(rèn)為高表達(dá)的CaR可以通過(guò)增強(qiáng)CaM的表達(dá)提高CSE的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)H2S的分泌，最終達(dá)到抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。

PI3K/AKT信號(hào)通路是維持細(xì)胞生存、增殖最重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一〔10，11〕。PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是許多生命活動(dòng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子，可以通過(guò)激活或抑制其下游一系列底物調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等活動(dòng)。研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞中存在廣泛表達(dá)，是巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)具有第二信使特征脂類衍生物生成的重要信號(hào)通路，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的分子基礎(chǔ)〔12，13〕。近年來(lái)研究已經(jīng)證實(shí)，CaR的激活將影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，而PI3K/AKT信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞的泡沫化過(guò)程中起重要作用〔14〕。 本研究結(jié)果說(shuō)明，高表達(dá)的CaR可能是通過(guò)增強(qiáng)CaM的表達(dá)抑制 PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，阻礙動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

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〔2016-03-17修回〕

(編輯徐杰)

The regulating of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages

LI Chen-Guang, LIU Fei, ZHANG Feng-Xiang.

The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

ObjectiveTo study the regulation of calcium sensing receptor on the expression of CSE of macrophages.MethodsThe expressions of CSE,PI3K and p-AKT were detected by Western blot.Sensitive sulphur electrode method was used to detect the change of the H2S content in macrophages;the relative content of positive cells was tested by oil red O staining and HPLC was used to measure the intracellular cholesterol content.ResultsThe expression of CSE was significantly enhanced in GdCl3group,while the expressions of PI3K and p-AKT were significantly inhibited in GdCl3group.The expressions of PI3K and p-AKT were significantly enhanced in GdCl3+U73122 and U73122 groups,while the expression of CSE was significantly inhibited in GdCl3+U73122 and U73122 groups.Compared with that of blank control group,the relative content of H2S after acted on foam cells 48h was increased in GdCl3group;while the relative contents of H2S in U73122 and GdCl3+ U73122 groups were significantly reduced.Compared with that of blank control group,the number of positive cells in GdCl3group was significantly decreased,while the number of positive cells were significantly increased in U73122 and GdCl3+ U73122 groups.ConclusionsCaR could depend on enhancing the expression of CSE to increase the secretion of H2S,thereby inhibit the transformation of macrophages into foam cells.

Calcium sensing receptor;Calmodulin；CSE

國(guó)家自然科學(xué)基金(81541099)

張鳳香(1978-)，女，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

李晨光(1979-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事腦血管病研究。

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)16-3871-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.002