于翠萍，蔡成法，李亞

(1.淄博市競技體育學(xué)校，山東 淄博　255000；2.山東省體育科學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南　250102；3.曲阜師范大學(xué)，山東 曲阜　273165)

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力竭運(yùn)動對小鼠空間記憶能力的影響

于翠萍1，蔡成法2，李亞3

(1.淄博市競技體育學(xué)校，山東 淄博255000；2.山東省體育科學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南250102；3.曲阜師范大學(xué)，山東 曲阜273165)

目的：探討力竭游泳運(yùn)動對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響，以及小鼠前腦皮層和海馬膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的作用。方法：建立反復(fù)力竭游泳運(yùn)動小鼠模型，通過Morris水迷宮檢測小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，采用免疫組化檢測力竭游泳運(yùn)動后即刻(0 h)、12 h、24 h和1 w小鼠前腦皮層、海馬膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)。結(jié)果：與對照組小鼠比較，反復(fù)力竭游泳組小鼠在力竭游泳后12 h和24 h小鼠的逃避潛伏期(訓(xùn)練周期1)顯著增加，第一象限停留時間明顯減少，小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與對照組小鼠比較，在力竭游泳后即刻(0 h)和12 h小鼠各腦區(qū)GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值均明顯增多(P<0.05，P<0.01)，力竭游泳后24 h，小鼠海馬DG和前腦皮層GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值明顯增多(P<0.05)；力竭游泳后一周，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：力竭游泳運(yùn)動導(dǎo)致了小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能減退，同時引起了海馬和前腦皮層GDNF的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的升高；GDNF參與了中樞疲勞產(chǎn)生與恢復(fù)的生物學(xué)調(diào)控過程。

力竭運(yùn)動；空間記憶；GDNF；海馬；前腦皮層

近年來，運(yùn)動性疲勞一直是競技體育領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其是對運(yùn)動中樞疲勞的研究[1]。長期大運(yùn)動量訓(xùn)練后，中樞疲勞一旦發(fā)生，將會引起機(jī)體發(fā)生一系列改變，如動作控制能力下降，學(xué)習(xí)記憶能力減弱，運(yùn)動認(rèn)知出現(xiàn)偏差等，繼而引起運(yùn)動成績下降。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的主要原因可能是，過度運(yùn)動應(yīng)激導(dǎo)致了前腦皮層和海馬的損傷[2]。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)在神經(jīng)元細(xì)胞的生長與死亡調(diào)控過程中發(fā)揮了不可替代的作用，其生物學(xué)效應(yīng)倍受關(guān)注[3]。研究表明，GDNF在神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)相關(guān)細(xì)胞中有廣泛表達(dá)。當(dāng)大鼠受到外傷性腦損傷后，對受損海馬部位的GDNF進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GDNF表達(dá)增強(qiáng)[4]。本研究通過檢測力竭游泳運(yùn)動后不同時間小鼠前腦皮層、海馬GDNF的表達(dá)，探討過度運(yùn)動應(yīng)激引起中樞疲勞產(chǎn)生及恢復(fù)的可能機(jī)制，為運(yùn)動訓(xùn)練調(diào)控提供理論依據(jù)。

1　研究對象與方法

1.1研究對象

3月齡小鼠20只(健康昆明品系，雌雄各半)，體重22～26克，山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料，自由飲食，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。溫度24℃～26℃，相對濕度40%～60%。

將動物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為2組，對照組10只，運(yùn)動組10只。

1.2建立力竭運(yùn)動模型

適應(yīng)性訓(xùn)練：30±2℃水溫，適應(yīng)性自由泳訓(xùn)練3 d，第一天15 min，第二天30 min，第三天45 min。

反復(fù)性力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練：連續(xù)4周，每周游泳訓(xùn)練5天，每天1次，均游泳至力竭；為避免小鼠產(chǎn)生適應(yīng)現(xiàn)象，在訓(xùn)練的后期增加訓(xùn)練強(qiáng)度(加2%體重的負(fù)重物)。訓(xùn)練結(jié)束后，撈起吹干，放回籠中休息。

力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn)為： 1) 動作失調(diào)，無法堅(jiān)持繼續(xù)游泳；2) 沉入水底，超過3 s不能回到水面。

1.3檢測學(xué)習(xí)記憶能力

力竭游泳運(yùn)動后12 h、24 h和1周，分別實(shí)施Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：均等劃分水迷宮為4個象限，第Ⅰ象限為目標(biāo)象限(置有平臺)，2 d時間里，對小鼠進(jìn)行每天8次的找平臺訓(xùn)練(上午和下午各訓(xùn)練4次，每次2 min)。每次記錄下小鼠尋找到隱藏在水下平臺的時間(逃避潛伏期escape latency)；空間搜索實(shí)驗(yàn)：第三天，撤除水下平臺，將小鼠從從第三象限放入，記錄120 s內(nèi)小鼠在4個象限的游泳時間，衡量小鼠對原目標(biāo)象限的記憶保持情況。

1.4前腦皮層和海馬免疫組織化學(xué)染色

水迷宮實(shí)驗(yàn)后即刻，注射0.4%的戊巴比妥鈉，麻醉小鼠，開胸灌注生理鹽水和預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液；斷頭取腦，固定，脫水，透明，石蠟包埋，制備切片(片厚5 μm)。將切片脫蠟水化，去除內(nèi)源性酶后，嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色程序、SABC試劑盒操作說明進(jìn)行。選擇小鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、齒狀回(DG)和前腦皮層(PFC)，切片后隨機(jī)選取視野，400倍顯微拍照，Motic Images Advanced 3.2圖像處理系統(tǒng)分析測量GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值。

1.5數(shù)理統(tǒng)計方法

2　結(jié)果

2.1小鼠空間學(xué)習(xí)能力測試結(jié)果

圖1　力竭游泳運(yùn)動后各組小鼠逃避潛伏期的變化(秒)注：control ，對照組；12 h、24 h、1 w ，力竭游泳后12 h、24 h、1周；training period ，訓(xùn)練周期。*P <0.05，與對照組比較；**P <0.01，與對照組比較； s。

小鼠空間定位航行和空間搜索能力測試結(jié)果如圖1所示，隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，對照組和力竭游泳后各組小鼠的逃避潛伏期均出現(xiàn)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。力竭游泳運(yùn)動后12 h，小鼠1～4訓(xùn)練周期的逃避潛伏期均非常顯著高于對照組(P<0.01)，力竭游泳運(yùn)動后24 h的小鼠各訓(xùn)練周期逃避潛伏期表現(xiàn)出相似的特征；與對照組相比，力竭游泳運(yùn)動后1 w小鼠在訓(xùn)練周期3和4時的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)；與力竭游泳運(yùn)動后12 h和24 h組相比，小鼠力竭游泳運(yùn)動后1 w后各訓(xùn)練周期的逃避潛伏期出現(xiàn)不同程度的下降。結(jié)果表明，反復(fù)力竭游泳運(yùn)動后12 h和24 h可導(dǎo)致小鼠空間學(xué)習(xí)能力降低，力竭游泳運(yùn)動后1周小鼠的空間學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。

2.2小鼠空間搜索記憶能力測試結(jié)果

空間搜索實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠游泳時間測試結(jié)果如表1所示。各組小鼠在第一象限的游泳時間均高于第二、三和四象限，尤其是對照組和力竭游泳運(yùn)動后1周組，小鼠在第二、三和四三個象限的游泳時間顯著低于第一象限的游泳時間(P<0.05,P<0.01)；與對照組比較，力竭運(yùn)動游泳運(yùn)動后12 h小鼠第一象限停留時間非常顯著減少(P<0.01)，力竭運(yùn)動游泳運(yùn)動后24 h小鼠第一象限停留時間顯著減少(P<0.05)，但比力竭游泳運(yùn)動后12 h組有所增加。測試結(jié)果說明，小鼠力竭游泳運(yùn)動后12h，其空間記憶保持能力非常顯著減弱，力竭游泳運(yùn)動后24h，其空間記憶保持能力顯著減弱。

表1　各組小鼠在四個象限的游泳時間統(tǒng)計表(秒，

注：*P<0.05，與對照組比較；**P<0.01，與對照組比較；+P<0.05與第一象限比較；++P<0.01，與第一象限比較。

2.3力竭運(yùn)動后小鼠前腦皮層和海馬GDNF的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，GDNF陽性細(xì)胞在海馬和前腦皮層廣泛表達(dá)(見圖2)。各組小鼠海馬和前腦皮層的GDNF陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。對照組、力竭游泳后一周組小鼠腦區(qū)GDNF表達(dá)相對較多，CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)和前腦皮層GDNF陽性細(xì)胞均分布廣泛，細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)規(guī)整。力竭游泳后即刻(0 h)和12 h小鼠各腦區(qū)GDNF陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，排列較為松散。力竭游泳后即刻24 h小鼠海馬DG區(qū)和前腦皮層GDNF表達(dá)相對較低，陽性細(xì)胞數(shù)目減少。

各組小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)和前腦皮層GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值的計算結(jié)果如表2所示。與對照組相比，力竭游泳后即刻(0 h)和12 h小鼠各腦區(qū)GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值均明顯增多(P<0.05，P<0.01)，說明小鼠各腦區(qū)GDNF的表達(dá)顯著減少；力竭游泳后24 h，小鼠海馬DG和前腦皮層GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值明顯增多(P<0.05)；力竭游泳后一周，小鼠各腦區(qū)GDNF陽性細(xì)胞平均目標(biāo)灰度值與正常對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，說明各腦區(qū)GDNF的表達(dá)有所恢復(fù)。結(jié)果表明，力竭游泳運(yùn)動后腦海馬CA1、CA3、DG和前腦皮層GDNF的表達(dá)明顯降低。

組別CA1CA3DGPFC對照組114.56±1.81126.38±1.35139.46±1.11115.68±1.35力竭游泳組0h142.32±1.56**142.23±1.5**153.51±0.83**129.68±1.26** 12h142.38±1.43**140.11±1.87*150.76±0.68**130.54±1.38** 24h139.16±1.23139.64±2.11148.43±0.61*127.39±1.31* 1周128.34±1.12135.65±2.48143.62±1.42125.62±1.54

注：*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較。

3　討論

適當(dāng)運(yùn)動可改善腦的學(xué)習(xí)與記憶功能，但過度運(yùn)動可能引起大腦神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)性損傷，一旦導(dǎo)致運(yùn)動性中樞疲勞發(fā)生，就會造成運(yùn)動過程中神經(jīng)調(diào)節(jié)功能減退[5]。研究表明，海馬與記憶能力及空間認(rèn)知能力有關(guān)，其中海馬CA3區(qū)與空間認(rèn)知性的學(xué)習(xí)能力有著密切關(guān)系[6]。在力竭訓(xùn)練引起的海馬神經(jīng)元功能改變過程中，海馬內(nèi)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)對海馬神經(jīng)元的損傷起保護(hù)作用[7]。長期大運(yùn)動量訓(xùn)練作為一種慢性應(yīng)激，可影響腦內(nèi)海馬和大腦皮層神經(jīng)元的功能活動。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，通過長時間低強(qiáng)度的跑臺運(yùn)動訓(xùn)練可顯著提高大鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶功能[8]。這種改變可能與運(yùn)動應(yīng)激改善了海馬區(qū)突觸可塑性有關(guān)，在海馬區(qū)功能改善的過程中神經(jīng)營養(yǎng)因子可能發(fā)揮了重要作用[9]。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是一種在體內(nèi)有廣泛表達(dá)并且作用復(fù)雜的多效能神經(jīng)營養(yǎng)因子，其對由于過度運(yùn)動應(yīng)激及腦缺血等因素引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，在海馬和前額葉皮質(zhì)中均檢測到了GDNF表達(dá)的增強(qiáng)[10]，這可能是神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷后啟動自我修復(fù)機(jī)制中的重要因素。GDNF表達(dá)異?？赡軙苯佑绊懘笫蠛ｑR突觸傳遞效能，繼而導(dǎo)致大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降[11]。另有研究表明，海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū), 且在介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[12,13]。慢性應(yīng)激在影響腦內(nèi)海馬的同時，對前額葉、杏仁核等腦區(qū)也有影響[14]。因此推測本研究中小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能減退以及運(yùn)動性中樞疲勞的產(chǎn)生和恢復(fù)可能與海馬和前腦皮層GDNF的表達(dá)密切相關(guān)。

4　小結(jié)

4.1力竭游泳運(yùn)動引起小鼠空間記憶保持能力下降，海馬及前腦皮層神經(jīng)組織受損，繼而導(dǎo)致海馬和前腦皮層神經(jīng)組織中GDNF的表達(dá)上調(diào)，暗示GDNF參與了運(yùn)動疲勞適應(yīng)過程中的神經(jīng)組織細(xì)胞修復(fù)過程。

4.2力竭運(yùn)動后不同時間GDNF動態(tài)變化特點(diǎn)表明，GDNF參與了運(yùn)動引起的中樞疲勞產(chǎn)生與恢復(fù)的生物學(xué)調(diào)控過程，這將為研究運(yùn)動訓(xùn)練及比賽中產(chǎn)生的中樞疲勞問題提供理論依據(jù)。

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Effects of exercise on the spatial learning- memoryability in mice

YU Cui-ping1,CAI Cheng-fa2,LI Ya3

(1.ZiboCompetitiveSportsSchool,Zibo,255000Shandong; 2.ShandongResearchCenterofSportsScience,Jinan,250102Shandong; 3.QufuNormalUniversity,Qufu,273165Shandong,China)

Objective: To study the effect of exhausted swimming exercise on spatial learning- memory function, and the role of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) of prefrontal cortex (PFC) and hippocampus (HP) in mice.Methods: The repeatedly exhausted exercise model mice were applied. The spatial learning-memory ability of mice were tested using Morris water maze task. The expression of GDNF in HP and PFC were detected by immunohistochemical method, at 0 (immediately),12 h,24 h and 1 week after repeatedly exhausted exercise, respectively.Results: Compared with control mice, the escape latency were significantly increased, and the swimming time of first quadrants were significantly decreased at 12 h, 24 h in exhaustive exercise group mice(P<0.01,P<0.05), after repeatedly exhausted exercise. The ability of spatial learning and memory of the exhaustive exercise group mice were significantly reduced. Compared with control group mice, the average target gray value of GDNF in PFC and HP of exhaustive exercise group mice were significantly increased at 0 h and 12 h (P<0.05,P<0.01), and were significantly increased at 24 h in DG and PFC of mice brain, after repeatedly exhausted exercise. There were not significant difference the average target gray value of GDNF at 1 week after exhausted exercise.Conclusion: Exhausted swimming exercise resulted in a decrease in spatial learning and memory in mice, and increased the expression of GDNF in HP and PFC; GDNF is involved in the biological control of central fatigue and recovery .

exhausted exercise; spatial memory; GDNF; hippocampus; prefrontal cortex

2016-05-06

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項(xiàng)目“力竭游泳運(yùn)動對小鼠前腦皮層和海馬神經(jīng)元的影響及其機(jī)制”(項(xiàng)目編號:BS2012SW021)。

于翠萍(1979-)，女，高級教練員，研究方向運(yùn)動訓(xùn)練學(xué)。

G 804.5

A

1009-9840(2016)04-0055-04