鄭小春　　林敬陽　　方晴霞　　曹鴻峰

1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州　310014；2.浙江省人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州　310014；3.浙江省人民醫(yī)院肛腸外科，浙江杭州　310014

Real time PCR 檢測(cè)L1-CAM在大腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

鄭小春1林敬陽2方晴霞1曹鴻峰3

1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州310014；2.浙江省人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江杭州310014；3.浙江省人民醫(yī)院肛腸外科，浙江杭州310014

目的 探討L1細(xì)胞黏附分子（L1-CAM）在大腸癌中的表達(dá)情況及其與臨床病理的相關(guān)性。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)浙江省人民醫(yī)院58例大腸癌組織及其癌旁正常組織中L1-CAM的表達(dá)，分析L1-CAM在大腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果 癌組織和癌旁正常組織L1-CAM mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。癌組織L1-CAM mRNA表達(dá)與腫瘤分化程度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期密切相關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤類型無明顯相關(guān)（均P＞0.05）。結(jié)論L1-CAM在大腸癌組織中高表達(dá)，并且與大腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

大腸癌；L1細(xì)胞黏附分子；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

［Abstract］Objective To investigate the L1-CAM mRNA expression in cancerous tissue of patientswith colorectal carcinoma and to evaluate the relationship between L1-CAM mRNA expression and clinicopathological significance. Methods Cancerous tissue and para-carcinoma tissue samples were collected from 58 patientswith colorectal carcinoma from Zhejiang Provincial People's Hospital.Real time PCR was used to detect the L1-CAM mRNA expression in cancerous tissue and para-carcinoma tissue，and the relationships between L1-CAM mRNA expression and pathologic parameterswere observed.Results The expression of L1-CAM mRNA was significantly higher in cancerous tissue than in para-carcinoma tissue（P＜0.05）.L1-CAM mRNA expression was found to be significantly related with the pathologic parameters，such as depth of differentiation，venous invasion，lymphatic invasion，lymph node metastasis，and clinicopathological stage（Dukes），with statistically significant differences（P＜0.05）；however，no significant association between L1-CAM mRNA expression and age，sex，tumor size，or the type of tumorwere found（all P＞0.05）.Conclusion The high expression of L1-CAM may be related with the devolopmentand progression of colorectal cancer.

［Key words］Colorectal carcinoma；L1-CAM；Real time PCR

L1細(xì)胞黏附分子（L1 cell adhesionmolecules，L1-CAM）是分子量為200～220 kD的免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，是主要介導(dǎo)細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間黏附作用的細(xì)胞表面糖蛋白，其胞外域由6個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白區(qū)域、5個(gè)纖維連接蛋白區(qū)域以及由85～147個(gè)氨基酸組成的疏水跨膜細(xì)胞質(zhì)區(qū)域組成［1］。研究發(fā)現(xiàn)，L1-CAM對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起著關(guān)鍵的作用：最初它是在神經(jīng)元細(xì)胞特別是神經(jīng)鞘細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)L1-CAM陽性的神經(jīng)細(xì)胞突起生長，參與細(xì)胞間接觸、黏附、軸索的遷移、分化成纖維束。L1-CAM主要通過嗜同性和嗜異性兩者相結(jié)合機(jī)制與鄰近細(xì)胞結(jié)合，從而將細(xì)胞黏附在一起。

近年來大量研究結(jié)果顯示，L1-CAM在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了非常重要的角色。L1-CAM在人類正常組織中表達(dá)是缺失的，但在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等［2-5］，并在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤血管生成等一系列過程中起著重要作用。研究顯示，L1-CAM常表達(dá)于實(shí)體腫瘤侵襲邊緣，與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-8］。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)大腸癌患者癌組織與癌旁正常組織L1-CAM mRNA表達(dá)的差異，并分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探討大腸癌發(fā)病的機(jī)制和診治研究提供新的思路。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

收集2012年1月～2014年12月于浙江省人民醫(yī)院肛腸外科行大腸癌手術(shù)患者的組織標(biāo)本58例為實(shí)驗(yàn)組，另選擇癌旁正常組織為對(duì)照組。全部病例均經(jīng)手術(shù)和病理檢查證實(shí)，術(shù)前均未接受化療及放療。58例患者中，男34例，女24例；年齡35～82歲，中位年齡為56歲；結(jié)腸癌23例，直腸癌35例；腫瘤病理組織學(xué)類型：黏液腺癌16例，乳頭狀腺癌9例，管狀腺癌33例；大腸癌分期按Dukes法，A期14例，B期20例，C期16例，D期8例。

1.2儀器與試劑

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（MBIFermentas公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），實(shí)時(shí)熒光PCR儀（德國Roche公司）。

1.3方法

1.3.1設(shè)計(jì)與合成在GENEBANK查到引物基因序列，使用軟件Primer Express 2.0進(jìn)行設(shè)計(jì)。L1-CAM基因引物序列：上游5'-GGCACCAAATGGCTGTGAAG-3'；下游3'-CCAAAGGCCTTCTCCTCGTT-5'；產(chǎn)物大小256 bp。內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游5'-AGAA GGCTGGGGCTCATTTG-3'；下游3'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-5'；產(chǎn)物大小258 bp。

1.3.2標(biāo)本制備標(biāo)本采集后迅速放到液氮中冷凍，置于-80℃冰箱保存。

1.3.3RNA提取和cDNA合成取50～100 mg組織樣本用液氮研磨，加入Trizol中充分裂解后，加0.2 mL氯仿4℃離心15min，取上清加入500μL預(yù)冷的異丙醇，-20℃沉淀35 min以上，取出后4℃離心10 min，棄去液體加入1 mL 80%乙醇，4℃離心10 min，棄去乙醇后室溫下晾干3～5min，加入50～100μL Nuclease-free water溶解 RNA。用 NanoDrop 1000測(cè)定RNA濃度。取總RNA 2μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照說明書要求進(jìn)行cDNA合成，所合成的cDNA置于-20℃冰箱保存。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR L1-CAM mRNA和GAPDH mRNA的反應(yīng)液組成：Nuclease-free water 5μL，5× RT Buffer 2μL，RT Enzyme Mix 0.5μL，Primer Mix 0.5μL，RNA 2μg。PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20μL，包括SYBG 10μL，H2O 7.2μL，Primer F 0.4μL，Primer R 0.4μL，上述反應(yīng)液2μL。反應(yīng)條件：95℃變性1min，95℃5 s，60℃15 s，72℃20 s，共35個(gè)循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)椋?5～95℃每5秒增加0.5℃。每個(gè)樣本都做3個(gè)復(fù)孔。

1.3.5PCR產(chǎn)物定量的校正和判定分析采用相對(duì)定量法，在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定內(nèi)參基因GAPDH，用以標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)本。根據(jù)Real time PCR原理，CT值和樣本起始拷貝數(shù)呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，CT值越高，起始拷貝數(shù)越少，利用CT值就可以計(jì)算L1-CAM和GAPDH的比值，即靶基因表達(dá)水平=靶基因CT值/內(nèi)參CT值，以此比值做統(tǒng)計(jì)處理。該比值與mRNA實(shí)際表達(dá)值成反比，即比值越高，實(shí)際表達(dá)值越低。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1L1-CAM在大腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

大腸癌組織和癌旁正常組織均表達(dá)L1-CAM mRNA，其表達(dá)水平分別為（0.988±0.486）和（1.412± 0.413），大腸癌組織中L1-CAM mRNA表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

2.2癌組織L1-CAM表達(dá)與大腸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

L1-CAM mRNA表達(dá)與大腸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表1。從表中可知，L1-CAM表達(dá)與分化程度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期密切相關(guān)（均P＜0.05）；而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤類型無明顯相關(guān)（均P＞0.05）。該結(jié)果表明L1-CAM與大腸癌的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

3　討論

L1-CAM細(xì)胞黏附分子是細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族中的重要成員之一。L1-CAM作為Wnt/ β-catenin（β-cat）/LEF/TCF信號(hào)通路的靶基因，通常在正常人類組織中表達(dá)缺失，而當(dāng)Wnt信號(hào)通路組成元件發(fā)生突變時(shí)，由于β-cat的降解受到抑制，使得胞質(zhì)聚集并形成β-cat/LEF/TCF復(fù)合體，該復(fù)合體與L1-CAM基因啟動(dòng)子上的β-cat/LEF/TCF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合即可促進(jìn)L1-CAM基因啟動(dòng)子的表達(dá)［9-10］。實(shí)驗(yàn)證明，采用siRNA干擾腫瘤細(xì)胞β-cat的表達(dá)后，L1-CAM的表達(dá)也相應(yīng)地明顯降低，說明L1-CAM的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切的相關(guān)性［11］。事實(shí)上，L1-CAM在多種惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)，并在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤血管生成等一系列過程中起著重要作用［12-15］。本研究結(jié)果顯示，大腸癌患者癌組織L1-CAM mRNA表達(dá)強(qiáng)度顯著高于癌旁正常組織，說明L1-CAM的過度表達(dá)同樣與大腸癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，大腸癌癌細(xì)胞從中度異型增生發(fā)展到重度異型增生是一個(gè)逐漸演變的過程，這一過程可能是通過自分泌或旁分泌的作用方式促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和發(fā)展［16］。

表1　L1-CAM表達(dá)與大腸癌臨床病理指標(biāo)關(guān)系（±s）

表1　L1-CAM表達(dá)與大腸癌臨床病理指標(biāo)關(guān)系（±s）

臨床特征　　例數(shù)　L1-CAM mRNA水平　P值性別0.523男女34 24 0.956±0.401 1.033±0.389年齡≤60歲＞60歲腫瘤大小≤5 cm＞5 cm腫瘤類型乳頭狀腺癌/管狀腺癌黏液腺癌分化程度高分化中低分化靜脈侵犯0.167 35 23 0.905±0.476 1.114±0.399 0.451 39 19 1.014±0.355 0.935±0.478 0.082 42 16 1.022±0.397 0.898±0.496 0.026 9 49 1.379±0.433 0.916±0.463 0.035有無20 38 0.799±0.369 1.087±0.412淋巴管侵犯0.018有無21 37 0.784±0.432 1.104±0.445淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.022有無23 35 0.820±0.395 1.098±0.485 Dukes分期A/B C/D 0.029 34 24 1.110±0.425 0.815±0.399

腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，分析判斷腫瘤細(xì)胞的浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移對(duì)評(píng)估患者預(yù)后及復(fù)發(fā)密切相關(guān)［16-18］。Gavert等［19］將L1-CAM呈陽性表達(dá)的結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞系中加入去整合素樣金屬蛋白酶10水解L1-CAM，其可溶性片段通過尾靜脈注射到成瘤小鼠體內(nèi)，研究結(jié)果證實(shí)，L1-CAM可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移。Kajiwara等［20］采用逆轉(zhuǎn)錄PCR研究發(fā)現(xiàn)，侵襲邊緣的L1-CAM mRNA表達(dá)水平顯著高于中心區(qū)域的癌細(xì)胞，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該結(jié)果提示L1-CAM表達(dá)與結(jié)腸癌的惡性程度密切相關(guān)。本研究表明，隨著大腸癌臨床病理分期的升高，L1-CAM mRNA表達(dá)明顯上升，大腸癌Dukes C、D期L1-CAM的表達(dá)明顯高于A、B期（P＜0.05）。癌組織中L1-CAM mRNA的表達(dá)在不同分化程度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期的腫瘤組織具有顯著性差異。L1-CAM在有轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)傾向的大腸癌組織中表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的大腸癌組織，這表明L1-CAM表達(dá)越高，大腸癌的增殖活性就越強(qiáng)，其浸潤、轉(zhuǎn)移的可能性也就越大。研究結(jié)果提示L1-CAM參與大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，L1-CAM的表達(dá)是一個(gè)對(duì)臨床評(píng)估大腸癌預(yù)后非常有意義的參考指標(biāo)，可為臨床評(píng)估預(yù)后、判定復(fù)發(fā)提供客觀科學(xué)的理論依據(jù)。目前針對(duì)L1-CAM的抗體正在研究之中，其有望成為臨床上大腸癌化學(xué)藥物治療的新靶點(diǎn)［21-26］。

［1］Takeda Y，Asou H，MurakamiY，etal.A nonneuronal isoform of cell adhesion molecule L1：Tissue-specific expression and functionalanalysis［J］.JNeurochem，1996，66（6）：2338-2349.

［2］Doberstein K，Milde-Langosch K，etal.L1CAM isexpressed in triple-negative breast cancers and is inversely correlated with Androgen receptor［J］.BMCCancer，2014，15（14）：958.

［3］Thike AA，Chong YZ，Cheok PY，et al.Loss of androgen receptor expression predicts early recurrence in triplenegative and basal-like breast cancer［J］.Modern Pathology，2014，27（3）：352-360.

［4］Schirmer U，Doberstein K，Rupp AK，etal.Role ofmiR-34a as a suppressor of L1CAM in endometrial carcinoma［J］. Oncotarget，2014，5（2）：462-472.

［5］Hou Z，Yin H，Chen C，et al.microRNA-146a targets the L1 cell adhesion molecule and suppresses the metastatic potential of gastric cancer［J］.Mol Med Rep，2012，6（3）：501-506.

［6］Hai J，Zhu CQ，BandarchiB，etal.L1 celladhesionmolecule promotestumorigenicityandmetastaticpotentialinnon-small cell lung cancer［J］.ClinicalCancerResearch，2012，18（7）：1914-1924.

［7］Bosse T，NoutRA，Stelloo E，etal.L1 celladhesionmolecule is a strong predictor for distant recurrence and overall survival in early stage endometrial cancer：Pooled PORTEC trial results［J］.European Journal of Cancer，2014，50（15）：2602-2610.

［8］Dong HS，Min AK，Kim HS，etal.L1 celladhesionmolecule expression is associated with pelvic lymph nodemetastasis and advanced stage in diabetic patients with endometrial cancer：amatched case control study［J］.Journal of Cancer Prevention，2014，19（3）：231-239.

［9］Kiefel H，Bondong S，Hazin J，et al.L1CAM：amajor driver for tumor cell invasion and motility［J］.Cell Adh Migr，2012，6（4）：374-384.

［10］GavertN，VivantiA，Hazin J，etal.L1-mediated colon cancer cellmetastasis does not require changes in EMT and cancer stem cellmarkers［J］.Mol Cancer Res，2011，9（1）：14-24.

［11］Sung SY，Wu IH，Chuang PH，etal.Targeting L1 cell adhesion molecule expression using liposome-encapsulated siRNA suppresses prostate cancer bone metastasis and growth［J］.Oncotarget，2014，5（20）：9911-9929.

［12］Bondong S，Kiefel H，Hielscher T，et al.Prognostic significance of L1CAM in ovarian cancer and its role in constitutive NF-kappaB activation［J］.Ann Oncol，2012，23（7）：1795-1802.

［13］HaiJ，ZhuCQ，BandarchiBZ，etal.L1 celladhesionmolecule promotes tumorigenicity and metastatic potential in nonsmall cell lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2012，18（7）：1914-1924.

［14］Bosse T，NoutRA，StellooE，etal.L1 celladhesionmolecule is a strong predictor for distant recurrence and overall survivalin early stageendometrialcancer：Pooled PORTEC trial results［J］.Euro JCancer，2014，50（15）：2602-2610.

［15］DongHS，Min AK，Kim HS，etal.L1 celladhesionmolecule expression is associated with pelvic lymph nodemetastasis and advanced stage in diabetic patientswith endometrial cancer：amatched case control study［J］.Journal of Cancer Prevention，2014，19（3）：231-239.

［16］侍立志，王兆春.EGF，EGFR和PCNA表達(dá)與大腸癌臨床病理學(xué)特征及關(guān)系［J］.中國普通外科雜志，2004，13（4）：253-256.

［17］Kim KS，Min JK，Liang ZL，etal.Aberrant L1 celladhesion molecule affects tumor behavior and hemosensitivity in anaplastic thyroid carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2012，18（11）：3071-3078.

［18］劉亮洪.細(xì)胞粘附分子L1與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，27（8）：653-654.

［19］Gavert N，Shefer M，Raveh S，et al.Expression of L1-CAM and ADAM10 in human colon cancer cells induces metastasis［J］.Cancer Res，2007，67（16）：7703-7712.

［20］Kajiwara Y，Ueno H，Hashiguchi Y，et a1.Expression of L1 celladhesionmolecule andmorphologic features at the invasive front of colorectal cancer［J］.Am JClin Pathol，2011，136（1）：138-144.

［21］Suh DH，Kim MA，Kim HS，etal.L1 celladhesionmolecule expression isassociated with pelvic lymph nodemetastasis and advanced stage in diabetic patientswith endometrial cancer：amatched case control study［J］.JCancer Prev，2014，19（3）：231-239.

［22］王亞叢，李琦.中醫(yī)藥聯(lián)合化療對(duì)大腸癌根治術(shù)后減毒作用的研究［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（8）：20-24.

［23］Doberstein K，Harter PN，Haberkorn U，et al.Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT［J］.Int J Cancer 2015，136（5）：E326-339.

［24］任建琳，呂祥，陳文婷，等.健脾復(fù)方通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制裸鼠人大腸癌轉(zhuǎn)移［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2014，4（4）：23-25，28.

［25］Weidle UH，Eggle D，Kloslermann S.L1-CAM as a target for treatment of cancer with monoclonal antibodies［J］. Anticancer Res，2009，29（12）：4919-4931.

［26］Wolterrink S，Moldenhauer G，F(xiàn)ogel M，et al.Therapeutic antibodies to hunman L1CAM：functional characteriazation and application in amousemodel for ovarian carcinoma［J］.Cancer Res，2010，70（6）：2504-2515.

Expression of L1-CAM mRNA in patients with colorectal carcinoma detected by Real time PCR and its relationship with clinical significance

ZHENG Xiaochun1LIN Jingyang2FANGQingxia1CAO Hongfeng3
1.Department of Pharmacy，Zhejiang Provincial People's Hospital，Zhejiang Province，Hangzhou310014，China；2.Department of Cardiology，Zhejiang Provincial People's Hospital，Zhejiang Province，Hangzhou310014，China；3.Department of Anorectal Surgery，Zhejiang Provincial People's Hospital，Zhejiang Province，Hangzhou310014，China

R735.35

A

1673-7210（2016）09（b）-0092-04

2016-06-02本文編輯：程銘）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2015KYB018，2011 KYB013）；浙江省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2015ZQ006）；浙江省科技廳公益類項(xiàng)目（2016C33115）。

方晴霞（1966-），女，碩士，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)和腫瘤藥理研究。