張東強　　徐細明　　張美霞

武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢　430060

NEK2對肝癌細胞株HepG2遷移侵襲的影響及其機制的研究

張東強徐細明▲張美霞

武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

目的 探討NEK2基因?qū)θ烁伟┘毎闔epG2遷移侵襲能力的影響及其機制。方法 通過實時熒光定量PCR及Western blot法檢測4種人肝癌細胞系HepG2、Huh7、SMMC、7402中NEK2的表達水平，并選用正常肝細胞株LO2作為參考。設(shè)計siRNA序列轉(zhuǎn)染HepG2細胞，將HepG2細胞分為3組：空白對照組（細胞未做任何處理）、陰性對照組（細胞轉(zhuǎn)染無義序列）及干擾組（細胞轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA序列）。觀察轉(zhuǎn)染前后HepG2細胞中的NEK2表達水平變化。利用Transwell小室觀察轉(zhuǎn)染前后細胞遷移及侵襲能力的改變。應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)檢測MMP2、MMP9、TIMP-1蛋白的表達情況。 結(jié)果5種細胞株中，NEK2在HepG2細胞中的表達量最高，與LO2細胞比較差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HepG2細胞轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA后，與空白對照組及陰性對照組比較，干擾組NEK2的表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。Transwell小室檢測細胞遷移，空白對照、陰性對照的穿膜細胞數(shù)分別為（415.00±6.36）、（411.75±9.90），與干擾組比較（99.50±7.07），差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Transwell小室檢測細胞侵襲，空白對照組、陰性對照組的穿膜細胞數(shù)分別為（220.50±6.40）、（219.75± 3.54），與干擾組（38.50±3.54）比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，HepG2細胞中TIMP-1蛋白表達較空白對照組、陰性對照組明顯上調(diào)，而MMP2及MMP9蛋白表達明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結(jié)論NEK2可能通過TIMP-1、MMP2及MMP9調(diào)控人肝癌HepG2細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

NEK2；siRNA；遷移；侵襲

［Abstract］Objective To identify the effects of NEK2 on migration and invasion and the related mechanism in human liver cancer cells of HepG2.Methods Real-time PCR and Western blotwere used to detect the NEK2 expression in HepG2，Huh7，SMMC，7402 cell lines and LO2 as the control.To design siRNA sequence to transfect into the HepG2 cells.The experimentwas divided into three groups：blank control（cells with no disposes）；negative control（cellswere transfected withmeaningless sequence）and interference group（cellwere transfected with NEK2-siRNA sequence）.The expression level of NEK2 was observed before and after transfection.The transwell chamberswas employed to detect ability of migration and invasion of HepG2 cells.Western blot approach was used to detect the expression levels of MMP2，MMP9 and TIMP-1.Results In the five kinds of cell lines，the expression of NEK2 was the highest in HepG2 cells，compared with the LO2 cell the difference was significant（P＜0.01）.After transfection of HepG2 cells with NEK2-siRNA，the expression level of NEK2 was attenuated，compared with blank control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell migration capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（415.00± 6.36），（411.75±9.90），compared with the NEK2-siRNA group（99.50±7.07），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.Transwell chamber was used to detect cell invasion capacity，the transmembrane cell numbers in the blank control group，negative control group were（220.50±6.40），（219.75±3.54），compared with the NEK2-siRNA group（38.50±3.54），the differenceswere statistically significant（P＜0.01）.The protein expression of TIMP-1 in the NEK2-siRNA group was increased significantly，and the protein expression of MMP2 and MMP9 was decreased，compared with that in the blank control group and negative control group，the differenceswere significant（P＜0.05）.Conclusion NEK2 may regulate invasion and migration of HepG2 cells via TIMP-1，MMP2 and MMP9.

［Key words］NEK2；siRNA；Transference；Invasion

原發(fā)性肝癌是中國常見的消化系惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，每年有超過600 000人死于肝癌［1］。目前對于肝癌的治療方法仍以早期手術(shù)切除為主，結(jié)合化療、介入、射頻消融等手段［2］，雖可顯著改善患者的生活質(zhì)量，延長生命，但對于肝癌患者，復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是常見的死亡原因［3-4］。而現(xiàn)階段對于肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移這一死亡原因的分子機制研究并不清楚，前期實驗中，本研究組利用基因芯片發(fā)現(xiàn)mRNA NEK2在原發(fā)性肝癌組織中表達明顯升高（文章待發(fā)），因此，本研究擬通過小RNA干擾技術(shù)，探討NEK2對肝癌細胞株HepG2侵襲遷移的影響及作用機制的研究。

1　對象與方法

1.1肝癌細胞及主要試劑

由武漢大學人民醫(yī)院中心實驗室提供HepG2、Huh7、SMMC、7402人肝癌細胞株及正常細胞株LO2。從美國Hyclone公司購買胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶EDTA；脂質(zhì)體（LipofectaminerM2000）及Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRRPremix ExTaqTMI均購自Takara公司，GAPDH抗體、MMP2、MMP9、TIMP-1抗體、羊抗兔多克隆抗體等蛋白質(zhì)印記法所用相關(guān)抗體購自Abcam公司，NEK2及GAPDH引物序列均由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，NEK2上游引物序為5'-TGTCAGAAGATTCGGAGGAA-3'，下游引物序列為5'-TAACGGACGATGTTTGGATG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。根據(jù)NEK2的基因序列，實驗所需的3條NEK2-siRNA序列及陰性對照siRNA序列 （將目的siRNA序列打亂后重新組合所得的陰性對照組）均由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計并合成。針對NEK2的靶序列如下：

表1　設(shè)計的NEK2引物序列

1.2實驗方法

1.2.1肝癌細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細胞從-70℃低溫冰箱復蘇后，用含10%FBS的高塘培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2適宜條件下培養(yǎng)。取指數(shù)生長期HepG2細胞用胰蛋白酶消化，離心制成細胞懸液，以40%～50%接種于6孔板，培養(yǎng)過夜待細胞長到70%～80%后進行轉(zhuǎn)染。SiRNA制備：245μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)液稀釋5μL的siRNA，輕輕混勻，室溫靜置5 min；轉(zhuǎn)染試劑制備：245μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)液稀釋5μL的Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫靜置5min。然后將兩種液體混勻，總體積500μL，室溫下靜止20～30min。吸盡培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入1500μL無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)基，再加入500μL siRNA/Lipofectamine 2000的混合物每孔，輕輕晃動培養(yǎng)板，充分混勻，4～6 h后更換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48 h，用胰蛋白酶消化采集細胞，繼續(xù)下一步實驗。在轉(zhuǎn)染48 h后細胞提取總RNA，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染效率的檢測采用實時定量PCR。將實驗分為3組：轉(zhuǎn)染siRNA的HepG2細胞為干擾組，轉(zhuǎn)染無義序列的HepG2細胞為陰性對照組，未經(jīng)任何處理的HepG2細胞為空白對照組。

1.2.2Rea l-t ime PCR檢測NEK2 mRNA的表達 待HepG2細胞轉(zhuǎn)染至48 h，按照RNA提取的步驟進行NEK2 RNA的提取，并用紫外線分光光度計檢測其濃度與純度，然后進行逆轉(zhuǎn)錄。使用Applied Biosystems@7500 real-time PCR Systems熒光定量PCR儀檢測NEK2基因的表達，反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10μL，cDNA 1μL，DyeⅡ0.4μL，上游引物及下游引物0.8μL，無酶水（RNase Free H2O）7μL，每孔共20μL，每組設(shè)3個復孔。反應(yīng)條件：95℃10min，95℃15 s，53℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)，根據(jù)SDS軟件分析數(shù)據(jù)，計算 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的引物-Ct內(nèi)參引物），以 2-ΔΔCt分析NEK2mRNA的相對表達量。每個樣本在相同條件下重復3次。

1.2.3細胞遷移實驗采用24孔Transwell小室進行實驗，孔徑為8.0μm。在24孔板下室中加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基600μL。轉(zhuǎn)染24 h后消化收集細胞，用PBS洗3次，用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，在小室內(nèi)加入200μL細胞懸液，細胞密度為1×105/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。拿出Transwell小室，用棉球擦掉未穿過微孔膜的HepG2細胞，PBS洗后用4%預冷多聚甲醛固定10 min，DAPI避光染色5 min，在200倍倒置顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)，隨機計數(shù)10個視野中的細胞數(shù)目，每個標本重復3次。

1.2.4細胞侵襲實驗同樣采用孔徑為8.0μm 24孔Transwell小室進行實驗，與細胞遷移實驗區(qū)別的是，需要提前預冷實驗所需Matrigel膠、槍頭及離心管等，用預冷的無血清無雙抗培養(yǎng)基按1∶6的體積比稀釋Martrigel膠，取50μL鋪在預冷的Transwell小室底部膜的表面上，37℃孵育2 h使Matrigel膠凝固。消化收集轉(zhuǎn)染后24 h的細胞，PBS洗3次，消化后用無血清無雙抗的高糖培養(yǎng)基重懸細胞，使細胞密度為1×105/mL，取200μL細胞懸液加入小室，將600μL含10%FBS的高糖培養(yǎng)基加在24孔板下室，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。拿出小室，用棉球擦掉未穿過微孔膜的HepG2細胞，PBS洗后用4%預冷多聚甲醛固定10min，DAPI避光染色5min，在200倍倒置顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù)，隨機計數(shù)10個視野中的細胞數(shù)目，每個標本重復3次。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測干擾后相關(guān)蛋白的表達siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細胞48 h后，加入蛋白裂解液冰上裂解5 min，冷凍離心提取蛋白，進行定量，經(jīng)BCA法檢測蛋白濃度。將每個蛋白樣品40μg加樣后進行8%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h后，然后TBST洗3次，每次10min。分別加入一抗：NEK2一抗（1∶1000稀釋）、MMP2一抗（1∶1000稀釋）、TIMP-1一抗（1∶2000稀釋）、MMP9一抗（1∶1000稀釋）、GAPDH一抗（1∶10 000稀釋）4℃溫育過夜。次日TBST洗3次，再與稀釋1∶10 000羊抗鼠多克隆二抗作用30min，TBST洗3次。最后用ECL顯影液化學發(fā)光顯影，AlphaEaseFC凝膠圖像軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1肝癌細胞系中NEK2水平的測定

在4種人肝癌細胞株HepG2、Huh7、SMMC、7402及正常細胞株LO2中利用Real-time PCR檢測NEK2的表達量，結(jié)果可知：在LO2、Huh7、SMMC、HepG2、7402這5種細胞株中，NEK2的表達量在HepG2細胞中最高，與LO2細胞比較差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）（圖1A）。Western blot同樣在5種細胞株中檢測了NEK2的表達量，發(fā)現(xiàn)HepG2細胞中NEK2的表達量也是最高（P＜0.01）（圖1B），與Real-time PCR的檢測結(jié)果一致。因此，選取表達量最高的HepG2細胞作為后續(xù)實驗對象。

圖1　肝癌細胞及正常細胞中NEK2的表達

2.2細胞轉(zhuǎn)染效果觀察

2.2.1Rea l-t ime PCR檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中NEK2 mRNA的表達量采用Real-time PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中NEK2 mRNA的表達量，檢測結(jié)果提示：在轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA后，HepG2細胞中NEK2的表達量較空白對照組及陰性對照組明顯降低，尤其是NEK2-siRNA-2組的NEK2表達量最低，差異均有高度統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）（圖2A）。提示siRNA干擾NEK2的效率較高，能顯著降低HepG2細胞中NEK2的表達水平。

圖2　分別轉(zhuǎn)染三條干擾序列后HepG2細胞中NEK2的表達

2.2.2Wes te rn b l ot檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中NEK2蛋白的表達量采用Western blot同樣檢測在轉(zhuǎn)染48 h后HepG2細胞中NEK2的表達量，其結(jié)果提示，將灰度值掃描分析，NEK2在轉(zhuǎn)染組中的表達量空白對照組及陰性對照組明顯降低，其中在NEK2-siRNA-2組的NEK2表達量最低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2B）。根據(jù)Real-time PCR與Western blot的檢測結(jié)果可以看出，NEK2-siRNA序列2的轉(zhuǎn)染效果最好，能最大程度地抑制HepG2細胞中NEK2表達。因此，本研究挑選NEK2-siRNA-2序列為干擾序列。

2.3 siRNA干擾NEK2后對HepG2細胞遷移侵襲能力的影響及其機制

為了探討NEK2對肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究分別進行了鋪或不鋪Matrigel膠的Transwell實驗。轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，細胞遷移實驗顯示：干擾組、空白對照組、陰性對照組穿過微孔膜細胞數(shù)分別為 （99.5±7.07）、（415.00±6.36）、（411.75±9.9），與空白對照組及陰性對照組比較，干擾組中HepG2細胞的遷移能力降低較為顯著，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖3A：a～c；B：a）。提示NEK2基因?qū)epG2細胞的遷移具有促進作用。

轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA 48 h后，細胞侵襲實驗結(jié)果顯示，干擾組、空白對照組、陰性對照組穿過微孔膜細胞數(shù)分別為（38.50±3.54）、（220.50±6.40）、（219.75±3.54），與空白對照組及陰性對照組比較，干擾組中HepG2細胞的侵襲能力下降較為顯著，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖3A：d～f；B：b）。提示NEK2基因?qū)Ω伟┘毎那忠u也具有促進作用。

為進一步說明NEK2對HepG2細胞遷移及侵襲的具體影響，后續(xù)還觀察了遷移侵襲相關(guān)因子蛋白水平的變化，Western blot及蛋白定量分析顯示抑制NEK2的表達后，對侵襲轉(zhuǎn)移具有促進作用的蛋白MMP2及MMP9表達下調(diào)，而抑制轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白TIMP-1表達則上調(diào)，與空白對照組及陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3C）。說明抑制NEK2的表達后，MMP2及MMP9蛋白表達水平明顯下調(diào)，TIMP-1蛋白的表達則上調(diào)，這二者的共同作用導致了HepG2細胞的遷移侵襲能力的顯著降低。

圖3　轉(zhuǎn)染NEK2-siRNA-2序列后HepG2細胞遷移侵襲的影響及其相關(guān)蛋白因子的變化

3　討論

NEK2是一類絲氨酸-蘇氨酸激酶，是重要的中心體蛋白，參與細胞周期調(diào)控，是細胞周期調(diào)控蛋白激酶家族成員之一［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，NEK2高表達于乳腺癌［6-7］、卵巢癌［8］、結(jié)腸癌［9］、骨髓瘤［10］的細胞系中，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預后均有促進作用。體外研究也表明，干擾NEK2基因能增強化療對癌細胞增殖的抑制，并促進其凋亡［11］。

為了探討NEK2的表達是否對肝癌細胞HepG2也有影響，本研究采用siRNA技術(shù)干擾NEK2表達后觀察其對HepG2細胞遷移侵襲及其相關(guān)機制的影響。實驗結(jié)果提示，Real-time PCR及Western blot檢測證實轉(zhuǎn)染效果較成功，能有效地降低干擾組NEK2的表達水平。早期研究結(jié)果表明［12-13］，通過siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)下調(diào)NEK2的表達后，腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力降低甚為明顯?；诖耍狙芯坷肨ranswell小室觀察轉(zhuǎn)染后HepG2細胞的遷移及侵襲能力的改變。Transwell結(jié)果顯示干擾組中穿過微孔膜的細胞數(shù)量明顯比空白對照及陰性對照少，提示對NEK2基因功能進行抑制后，HepG2細胞的遷移及侵襲能力被抑制。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，也是其復發(fā)和致死的主要原因［14］，而據(jù)我們所知，惡性腫瘤的有著復雜的侵襲轉(zhuǎn)移的機制，大致可歸納為以下幾種：

①腫瘤細胞之間黏附性降低；②腫瘤細胞的黏附性增加，與細胞外基質(zhì)不易分離；③腫瘤細胞產(chǎn)生蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)及血管基底膜，侵犯進入血管或淋巴管內(nèi)，癌細胞可在遠處增殖形成轉(zhuǎn)移灶［15］。金屬蛋白酶是一組具有降解細胞外基質(zhì)和血管基底膜能力的蛋白酶，對多種腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移起促進作用［16］。其中MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成員，能溶解基底膜的重要組成部分Ⅳ膠原［17］，對惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移起著正向調(diào)控作用［18］。而金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是一類能與MMPs形成復合物，阻止MMPs的水解基底膜作用的分子家族，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四個分子［19］?；诖?，本研究進一步檢測轉(zhuǎn)染后侵襲相關(guān)蛋白的變化：Western blot結(jié)果提示，沉默NEK2的表達后，干擾組HepG2細胞中的MMP2、MMP9的表達降低，TIMP-1的表達則升高。從分子水平說明NEK2對HepG2遷移及侵襲的調(diào)控是通過上調(diào)MMP2、MMP9，下調(diào)TIMP-1實現(xiàn)的。因此，可推測NEK2基因在促進HepG2細胞遷移侵襲中有著正向調(diào)控作用，NEK2可能通過上調(diào)MMP9及MMP2，下調(diào)TIMP-1調(diào)控細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

Kokuryo等［20］利用siRNA技術(shù)對種植于裸鼠體內(nèi)的膽管上皮癌細胞進行NEK2基因沉默，發(fā)現(xiàn)膽管上皮癌的腹膜播散受到明顯抑制。Tsunoda等［12］也用siRNA干擾乳腺癌細胞株中NEK2基因的表達后，乳腺癌細胞的侵襲能力也明顯減低。本實驗結(jié)果與國外研究者在膽管癌和乳腺癌上關(guān)于NEK2對惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用一致，這可證實NEK2對肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移確實起促進作用。

綜上所述，本研究通過siRNA靶向干擾HepG2細胞中NEK2表達后，可以有效降低該細胞的遷移及侵襲能力。

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Effects of NEK 2 on migration and invasion of HepG2 in hepatoma cells and the related mechanism

ZHANG Dongqiang XU Ximing▲ZHANGMeixia
Cancer Center，Renmin Hospital ofWuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R735.7

A

1673-7210（2016）09（b）-0013-05

2016-05-05本文編輯：任念）

湖北省自然科學基金項目（2012FKC14301）。

張東強（1969.11-），男，武漢大學第一臨床學院2013級腫瘤專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：消化道腫瘤。