楊雪鵬，汪芳芳，崔君竹，葉建斌，馬　科

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

霍氏腸桿菌A20降解類胡蘿卜素的條件優(yōu)化

楊雪鵬，汪芳芳，崔君竹，葉建斌，馬科

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

為了提高類胡蘿卜素的降解率，以霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）A20菌株為對象，研究其培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、pH值、接種量）對類胡蘿卜素降解率的影響，并通過單因素和正交試驗(yàn)，以降解率為評價(jià)指標(biāo)，確定微生物的最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，培養(yǎng)條件的改變可以影響類胡蘿卜素的降解效果，各培養(yǎng)條件對類胡蘿卜素的降解率的影響程度不同。菌株A20降解類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間42 h，溫度25℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH值7.0，接種量1.0%，在此條件下，類胡蘿卜素降解率從最初的70.80%提高至91.53%。

類胡蘿卜素；降解率；條件優(yōu)化；正交試驗(yàn)

類胡蘿卜素是一類天然存在的脂溶性色素，具有抗氧化性，廣泛地存在于蔬菜、水果、鮮花以及一些微生物、昆蟲和海洋動物中，是一類重要的香料前體物質(zhì)［1］?，F(xiàn)在在自然界中發(fā)現(xiàn)了的類胡蘿卜素已經(jīng)有600多種［2］。類胡蘿卜素屬于四萜類化合物，典型的類胡蘿卜素由8個異戊二烯首尾相連構(gòu)成，其分子結(jié)構(gòu)中因存在較多的類異戊二烯共軛雙鍵，故具有較強(qiáng)的吸光性能，呈現(xiàn)出橙、黃、紅色［3］。

類胡蘿卜素的性質(zhì)極不穩(wěn)定，與氧氣在常溫條件下接觸可發(fā)生氧化反應(yīng)，7、8及9、10位的雙鍵最易發(fā)生氧化斷裂，產(chǎn)物多為含C9～C13之間的醛酮［4］。氧化降解時，類胡蘿卜素因雙鍵斷裂位置的不同，而產(chǎn)生不同的化合物，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化形成多種重要的香氣物質(zhì)［5］。如類胡蘿卜素降解可產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、β-大馬酮和巨豆三烯酮等芳香物質(zhì)，這些芳香物質(zhì)是植物花香和果香的來源［6］，且這些化合物還呈現(xiàn)出煙草特有的香味，在制備香精香料方面具有重要價(jià)值［7］。

類胡蘿卜素的降解方法主要有物理降解，化學(xué)降解和生物降解法。目前關(guān)于類胡蘿卜素降解的報(bào)道主要集中于物理降解和化學(xué)降解，而生物降解法尤其是利用酶和微生物來降解類胡蘿卜素產(chǎn)生香味物質(zhì)的研究還很少［8］。根據(jù)美國和歐盟的法律，生物降解將成為一個很引人矚目的發(fā)展方向，第一，其制得的香氣成分被看作是“天然成分”；第二，與化學(xué)合成相比，生物法消除了自然界中出現(xiàn)的旋光異構(gòu)現(xiàn)象，節(jié)省了后續(xù)的分離步驟［9］，第三，由于手性影響，對香氣感官有所改善。ABATE A等［10］指出，香水行業(yè)需要的手性化合物需要通過酶催化特別是脂肪酶介導(dǎo)的反應(yīng)制得。

為了進(jìn)一步提高類胡蘿卜素降解率，促進(jìn)香味物質(zhì)的生成，本研究以類胡蘿卜素降解菌A20為試驗(yàn)菌株，以類胡蘿卜素降解率為指標(biāo)，應(yīng)用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探討了影響類胡蘿卜素降解率的各種關(guān)鍵因素，以期得到發(fā)酵的最佳條件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（純度90%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；菌株：由前期試驗(yàn)，從煙葉中篩選出了一株能高效降解類胡蘿卜素的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子鑒定等手段，鑒定該菌株為霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）A20；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、K2HPO4、二氯甲烷、無水乙醇等；所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基：葡萄糖8 g、酵母膏14 g、蛋白胨7 g、K2HPO40.72 g、蒸餾水1 L，pH 7.0，滅菌后，類胡蘿卜素溶液使其終濃度為20 g/L，并無菌過濾。

類胡蘿卜素溶液：用200 mg的類胡蘿卜素分散在2 g吐溫-80中，溶解在400 mL二氯甲烷中，將溶劑減壓蒸出，溶解在10 mL無水乙醇中［11］。

1.2儀器與設(shè)備

BSD-YF3200恒溫振蕩器：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；1260 infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技公司；UV-2300紫外分光光度計(jì)：尤尼克（上海）有限公司；GR85DA高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；Hicen FR高速冷凍離心機(jī)：德國Herolab公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1工藝流程及操作要點(diǎn)

配制培養(yǎng)基→滅菌→加入2 mL類胡蘿卜素溶液→接種→培養(yǎng)→離心→萃取→濃縮→檢測類胡蘿卜素質(zhì)量濃度

將培養(yǎng)好的種子液按1%的接種量接入裝液量為100mL 250mL三角瓶中。在30℃、150r/min條件下，避光培養(yǎng)42h。發(fā)酵液在避光條件下，4℃6 500 r/min高速離心15 min。取上清液加入等體積的二氯甲烷反復(fù)萃取3次，得類胡蘿卜素提取物，加無水Na2SO4干燥過夜。45℃真空濃縮，蒸干溶劑，再加2 mL甲醇，過0.45 μm的有機(jī)系膜，待高效液相色譜分析，并以等體積不接菌培養(yǎng)基作為對照。

1.3.2單因素試驗(yàn)

在原有發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，分別考察培養(yǎng)時間（0、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h）、溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、轉(zhuǎn)速（50 r/min、100 r/min、150r/min、200 r/min、250 r/min）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對類胡蘿卜素降解率的影響。1.3.3正交試驗(yàn)

表1　類胡蘿卜素降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for carotenoids degradation conditions optimization

利用單因素試驗(yàn)的方法分析上述試驗(yàn)結(jié)果，選取溫度、轉(zhuǎn)速、接種量和pH值4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各設(shè)置3個不同的水平，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，各因素與水平見表1。每個試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)［12］。

1.3.4測定方法

菌液濃度的測定：取1 mL發(fā)酵液稀釋3倍，用紫外分光光度計(jì)測量菌液在波長600nm處的吸光度值，即OD600nm值。

［13］中HPLC分析條件、繪制類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算發(fā)酵液中胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。

類胡蘿卜素降解率的測定：按照參考文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行測定。以不加菌株A20的培養(yǎng)基為對照組。其計(jì)算公式為：

式中：C試驗(yàn)為試驗(yàn)組中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，mg/L；C對照為對照組中類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度，mg/L。

2　結(jié)果與分析

2.1類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照參考文獻(xiàn)［13］的色譜條件進(jìn)行測定，類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。峰面積（Y）與類胡蘿卜素質(zhì)量濃度（X）的回歸方程為Y=43.135X+57.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，表明在0～200mg/L范圍內(nèi)，類胡蘿卜素質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1　類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of carotenoids

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1培養(yǎng)時間優(yōu)化的結(jié)果

圖2　菌株A20的生長和降解動力學(xué)曲線Fig.2 Growth curve and carotenoids degradation kinetics curve of strain A20

由圖2可知，菌株A20在培養(yǎng)18 h后開始迅速繁殖；至36 h時，發(fā)酵液OD600nm值達(dá)到最高；42 h時，菌株A20對類胡蘿卜素的降解基本已經(jīng)結(jié)束。因此，本試驗(yàn)選擇42 h為最終降解時間。

2.2.2培養(yǎng)溫度優(yōu)化的結(jié)果

圖3　不同溫度對OD600nm值和類胡蘿卜素降解率的影響Fig.3 Effects of different temperature on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由圖3可知，在＜25℃時，隨溫度增加，菌體的代謝加快，加速酶的產(chǎn)生，降解率提高；在25℃時類胡蘿卜素的降解率達(dá)到78.6%，OD600nm值達(dá)到2.668；超過25℃后菌體的代謝受到一定程度的限制，產(chǎn)酶量下降，故降解率有所降低。但在溫度40℃時，類胡蘿卜素降解率突然提高，可能是因?yàn)轭惡}卜素高溫發(fā)生熱裂解。因此，溫度過高或者過低都不利于微生物的生長代謝和類胡蘿卜素的降解。因此，菌株A20降解類胡蘿卜素的最佳發(fā)酵溫度為25℃［14］。

2.2.3轉(zhuǎn)速優(yōu)化的結(jié)果

圖4　轉(zhuǎn)速對OD600nm值和類胡蘿卜素降解率的影響Fig.4 Effects of rotate speed on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由圖4可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在50～200 r/min時，隨轉(zhuǎn)速的增大，菌株的生物量在逐漸增大，類胡蘿卜素的降解率也在提高；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，類胡蘿卜素降解率達(dá)到最大，為81.5%，OD600nm值為2.75；說明該轉(zhuǎn)速下，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量更加有利于菌體的生長，故降解率最高。因此，菌株A20降解類胡蘿卜素的最佳搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。

2.2.4初始pH值優(yōu)化的結(jié)果

圖5　初始pH值對OD600nm值和類胡蘿卜素降解率的影響Fig.5 Effects of initial pH on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由圖5可知，當(dāng)pH值在6.0～7.0時，隨著pH值的增大，菌株的生物量和類胡蘿卜素的降解率也在提高；當(dāng)pH值在7.0～8.0時，隨著pH值的增大，菌株的生物量和類胡蘿卜素的降解率反而在降低；當(dāng)初始pH值為7.0時，菌株的生物量和類胡蘿卜素的降解率最高，降解率為81.8%，OD600nm值為2.721。因此，本試驗(yàn)選擇的最適pH值為7.0［15］。

2.2.5接種量優(yōu)化的結(jié)果

圖6　接種量對OD600nm值和類胡蘿卜素降解率的影響Fig.6 Effects of inoculum on OD600nmand degradation rate of carotenoids

由圖6可知，接種量為0.5%～1.5%時，營養(yǎng)物質(zhì)得到有效的利用，同時酶得到積累，因此降解率大幅提高；當(dāng)接種量為1.5%時，類胡蘿卜素的降解率達(dá)到最高，為87.3%，OD600nm值為2.814；但隨著接種量的增加，類胡蘿卜素的降解率減小，這主要是由于接種量過大，菌體快速生長，營養(yǎng)消耗過快且通氧量不足，使菌株穩(wěn)定期縮短，快速進(jìn)入衰老期，不利于酶的產(chǎn)生和積累［16］，從而使類胡蘿卜素的降解率下降。因此，本試驗(yàn)選擇1.5%為最佳接種量。

2.3正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

類胡蘿卜素降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表2、表3可知，A（溫度）、B（轉(zhuǎn)速）、C（接種量）、D（初始pH值）因素對類胡蘿卜素降解率的影響均極顯著。因素主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B。最佳培養(yǎng)條件為A2B1C1D2，即培養(yǎng)溫度為25℃，轉(zhuǎn)速150r/min，pH值為7.0，接種量為1.0%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，類胡蘿卜素降解率為91.53%。

表2　類胡蘿卜素降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for carotenoids degradation condition optimization

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量4個因素對類胡蘿卜素降解率均有極顯著影響（P＜0.01）。

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)合的方法對菌株Enterobacter hormaecheiA20降解類胡蘿卜素的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件。優(yōu)化結(jié)果表明，菌株A20降解類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間42 h，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，pH值7.0，接種量為1.0%。在此條件下，類胡蘿卜素降解率從優(yōu)化前的70.8%提高至91.53%。本試驗(yàn)的菌株A20在條件優(yōu)化后，能夠高效降解類胡蘿卜素，產(chǎn)生明顯的香味，對于提高商業(yè)價(jià)值、降低經(jīng)濟(jì)成本具有重要意義。

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Optimization of conditions for degradation of carotenoids byEnterobacter hormaecheiA20

YANG Xuepeng，WANG Fangfang，CUI Junzhu，YE Jianbin，MA Ke
（School of Food and Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，China）

In order to improve the degradation rate of carotenoids，withEnterobacter hormaecheiA20 as the object，the effects of culture time，temperature，speed，pH and inoculum on the degradation rate of carotenoids were studied.The optimum culture conditions were determined by single factor and orthogonal experiments with degradation rate as the index.Results indicated that the degradation rate of carotenoids was affected by the culture condition with different influential levels.The optimized culture conditions of the strain were as follows：culture time 42 h，temperature 25℃，rotate speed 150 r/min，pH 7.0，and inoculum 1.0%.Under the condition，carotenoids degradation rate increased from 70.80%to 91.53%.

carotenoids；degradation rate；conditions optimization；orthogonal test

TS201.3

0254-5071（2016）09-0125-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.028

2016-04-25

楊雪鵬（1973-），男，教授，博士，研究方向?yàn)闊煵莨こ膛c酶工程。