薛　健，王　歡，尹　銳

纖溶酶高產菌株的篩選與鑒定

薛健，王歡，尹銳

（吉林農業(yè)科技學院 生物工程分院，吉林 吉林 132101）

作為一種新型的溶血栓藥物，大豆類發(fā)酵食品中所含有的纖溶酶具有安全性好、作用迅速，成本低，以及可通過液體發(fā)酵大規(guī)模生產等優(yōu)點。采用酪蛋白平板法與纖維蛋白平板法相結合的方法，從市售納豆產品中分離篩選出一株高產纖溶酶生產菌，發(fā)酵48 h后，測得其粗酶活為483.72 IU/mL，通過形態(tài)學，生理生化特征，16S rDNA序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

纖溶酶；篩選；16S rDNA；鑒定

血栓性疾病嚴重威脅著人類的生命與健康，其發(fā)病率和死亡率高居各種疾病之首［1-2］。新型溶栓藥物的開發(fā)迫在眉睫，從傳統(tǒng)大豆類發(fā)酵食品中提取纖溶酶，是目前溶栓藥物開發(fā)的新方向之一。納豆激酶（narrokinase，NK）就是從日本傳統(tǒng)食品納豆中提取或納豆菌發(fā)酵生產的一種新型纖溶酶，其分子質量遠遠小于尿激酶（urokinase，UK）、鏈激酶（streptokinase，SK）、纖溶酶原（tissue plasminogen aetivator，tPA），具有可由腸道吸收、作用迅速、持續(xù)時間長的特性，還能激活體內的tPA，使之溫和、持續(xù)地提高血液的纖溶活性［3-5］。我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中也被發(fā)現含有與納豆激酶功能類似的纖溶酶［6-8］。這類來自大豆發(fā)酵食品中的纖溶酶具有諸多優(yōu)點，并可由微生物液體發(fā)酵獲得，酶活較高，成本低廉［9-11］，被認為是一種前景廣闊的溶栓藥物。

本研究利用收集的市售納豆與豆豉樣品，從中篩選出一株高產纖溶酶生產菌，并對其形態(tài)學特征、生理生化指標及分子生物學進行了鑒定，以期為心腦血管疾病相關保健產品與新型溶栓藥物的開發(fā)與應用創(chuàng)造良好的條件。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

市售豆豉及納豆樣品共8種，分別產自國內與日本。為方便起見，命名為豆豉1#，豆豉2#，豆豉3#，納豆1#，納豆2#，納豆3#，納豆4#，納豆5#。

纖維蛋白原（fibrinogen）、凝血酶（thrombin）、尿激酶（urokinase）、蛋白酶K、溶菌酶：美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）與溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、TE緩沖液（Tris-HCl與乙二胺四乙酸配制而成）：天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；其他試劑均為國產分析純。LA-TaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒：大連Takara公司。

斜面與平板培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉5 g/L，pH 7.0。

液體種子培養(yǎng)基與液體發(fā)酵培養(yǎng)基：采用LB液體培養(yǎng)基，組成除無瓊脂粉外同LB固體培養(yǎng)基；

酪蛋白平板：酪蛋白20 g/L（于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中微熱溶解），瓊脂粉15 g/L，pH 8.0。

1.2儀器與設備

TS-211C恒溫搖床：上海合恒儀器設備有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；DYY-12三恒多用電泳儀：北京六一儀器廠；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司。

1.3方法

1.3.1菌株分離

取上述不同品種的豆豉與納豆各5粒，分別放入50 mL無菌生理鹽水中，室溫浸泡12 h，5 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌生理鹽水懸垂含有菌體細胞的沉淀，以劃線分離法將菌懸液涂布在LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2酪蛋白平板初篩

挑取LB平板培養(yǎng)基上的單菌落接種至LB斜面培養(yǎng)基上，37℃活化24 h后，制備菌懸液。稀釋至10-3的濃度梯度菌懸液后，分別取0.1mL稀釋液涂布于酪蛋白平板，37℃培養(yǎng)24 h，測量酪蛋白平板透明圈直徑，選取透明圈直徑與菌落直徑比的均值較大的菌落接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)并保藏，用于復篩。

1.3.3搖瓶復篩

將初篩獲得的菌株轉接于新鮮的LB固體培養(yǎng)基斜面，活化24 h后，接種至液體種子培養(yǎng)基，在37℃、180 r/min的搖床培養(yǎng)24 h。以1%的接種量接種至裝液量為100 mL/ 250mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，取發(fā)酵24 h和48 h后的發(fā)酵液（實驗發(fā)現，上述菌株產酶高峰主要集中在24～48 h），10 000 r/min離心，取上清液，使用纖維蛋白平板法［12］測定酶活，選取酶活最高的菌株作為纖溶酶生產菌并進行下一步鑒定。在37℃、pH 7.4條件下，1 min內溶解1 nmol纖維蛋白的納豆激酶量為1 U。

1.3.4菌株鑒定

（1）形態(tài)學觀察和生理生化鑒定

將酶活最高的菌株進行個體形態(tài)和生理生化指標鑒定［13］。

（2）菌種的基因組DNA提取

取10mL過夜培養(yǎng)的菌液于15mL離心管，10000r/min、4℃離心10 min，棄去上清液；菌體沉淀用3 mL TE緩沖液（pH8.0）懸浮，并加入溶菌酶（終質量濃度1mg/mL）、180μL 10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白酶K（終質量濃度200 μg/mL），混勻，37℃溫育1 h；加入720μL5mol/LNaCl，再加入500 μL十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）/NaCl，混勻，65℃溫育30 min；用等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，5 000 r/min離心10 min，移取上清液至干凈離心管中；加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，10 000 r/min、4℃離心10 min，移取上清至干凈離心管中；加1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置10 min，10 000 r/min離心10 min得到DNA沉淀；加入500μL體積分數70%乙醇，10000r/min、4℃離心10 min洗滌DNA沉淀，烘干；用20 μL TE緩沖液溶解DNA，加入終質量濃度為20 μg/mL核糖核酸酶，4℃保存。

（3）菌種的16S rDNA擴增

以細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′）與1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rDNA擴增，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系體積為50 μL，包括10×PCR緩沖液（含Mg2+）5 μL；脫氧核糖核苷三磷酸（dexyribonucleoside niphosphate，dNTP）（25 mmol）4 μL；引物27F和1492R（5 μmol）各2 μL；LA-TaqDNA聚合酶2.5 U；模板5 μL，反應條件為：94℃預變性10 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物用經熒光染料染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物合成和DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

2　結果與分析

2.1纖溶酶高產菌株的初篩

圖1　纖溶酶生產菌的酪蛋白平板初篩結果Fig.1 Prescreening results of fibrinolysin producing strain with casein plate

纖溶酶生產菌的酪蛋白平板初篩結果見圖1。由于纖溶酶可在酪蛋白平板上產生溶圈，因此將溶圈直徑與菌落直徑比值作為初篩指標。在8種樣品中，豆豉2#，納豆2#，納豆4#與納豆5#的菌落產生的溶圈直徑與菌落直徑比值較大，表明其產酶能力較高，可用于下一步復篩。

2.2纖溶酶高產菌株的復篩

取豆豉2#，納豆2#，納豆4#與納豆5#菌株的發(fā)酵24 h和48 h后的上清液，采用纖維蛋白平板法檢測纖溶酶酶活，結果見圖2。結果表明，納豆4#菌株在發(fā)酵24 h與48 h后產酶酶活均最高，分別達到了305.64 U/mL和483.72 U/mL，因此將其作為纖溶酶生產菌保藏并進行下一步鑒定。

圖2　纖溶酶生產菌的纖維蛋白平板復篩結果Fig.2 Secondary screening results of fibrinolysin producing strain with fibrin plate

2.3菌株的形態(tài)學觀察與生理生化特征鑒定

納豆4#菌株的生理生化試驗結果見表1。由表1可知，納豆4#菌株呈桿狀，生有芽孢，革蘭氏染色為陽性，該菌株特性與枯草芽孢桿菌相似。

表1　納豆4#菌株的生理生化特征鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of Natto 4#strain

2.4菌株的16S rDNA鑒定［14-15］

提取納豆4#菌體細胞總DNA，利用細菌通用引物27F與1492R進行16S rDNA PCR擴增，電泳圖譜見圖3。直接測序結果表明，16S rDNA PCR擴增產物長度為1 398 bp。

圖3　納豆4#菌株16S rDNA擴增產物電泳圖譜Fig.3 Electrophoretic graph of PCR product of Natto 4#strain

2.5菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

利用上述同源性比較的檢索結果，從中選取與納豆4#菌株相似度較高的7株芽孢桿菌，從GenBank中下載其16S rDNA序列，使用Mega 5.1軟件的Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，屬于同一種、親緣關系最近的菌株被聚為1個分支，其中納豆4#菌株與Bacillus subtilisJCM1465聚為1個分支，與其他芽孢桿菌相距較遠，表明納豆4#菌株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣關系最近。將測序結果與美國國家生物技術中心（national center of bioteehnology information，NCBI）中芽孢桿菌16S rDNA基因序列進行同源性比較，納豆4#菌株的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌16S rDNA序列同源性達到100%。最后，綜合形態(tài)學，生理生化試驗，16S rDNA比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析的結果，將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4　納豆4#菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Natto 4#strain

3　結論

本研究采用酪蛋白平板法與纖維蛋白平板法兩種方法結合，從市售納豆與豆豉產品中分離篩選出一株高產纖溶酶生產菌，發(fā)酵48 h后，其粗酶活為483.72 U/mL，通過形態(tài)學、生理生化特征、16S rDNA序列鑒定與及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。本研究可為心腦血管疾病相關保健產品與新型溶栓藥物的開發(fā)與工業(yè)化生產提供前期基礎，具有良好的應用前景。

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Screening and identification of a strain with high yield fibrinolytic enzyme

XUE Jian，WANG Huan，YIN Rui
（Jilin Agricultural and Science Technology College，Jilin132101，China）

As a kind of new thrombolytics，the fibrinolytic enzyme in traditional fermented soybean food has the advantages of high safety，quick effect，low cost，and production by liquid fermentation.A high fibrinolytic enzyme producing strain was screened from the commercial natto products. After fermentation for 48 h，the enzyme activity was 483.72 IU/ml.The strain was identified asBacillus subtiliswith the methods of morphology，physiological，biochemical characteristics，16SrDNA sequence and phylogenetic tree analysis.

fibrinolytic enzyme；screening；16S rDNA；identification

Q939.97

0254-5071（2016）09-0106-03doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.024

2016-04-10

吉林省教育廳十二五科學技術研究項目（2012308）；吉林市科技局杰出青年培養(yǎng)專項（2013625016）

薛?。?979-），男，講師，博士，研究方向為微生物工程與代謝工程。