單之初，程　斐，沈　翔，陳瀚鋒，俞紅波，韋一馨，潘興祥*

（1.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 3120322；2.中國黃酒傳統(tǒng)釀制技藝研究中心，浙江 紹興 312032；3.紹興市柯橋區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心，浙江 紹興 312030）

傳統(tǒng)黃酒香蘭素含量影響因子的探討

單之初1，2，程斐1，2，沈翔1，2，陳瀚鋒3，俞紅波1，2，韋一馨1，2，潘興祥1，2*

（1.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 3120322；2.中國黃酒傳統(tǒng)釀制技藝研究中心，浙江 紹興 312032；3.紹興市柯橋區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心，浙江 紹興 312030）

香蘭素是黃酒中重要香氣物質(zhì)之一。該研究使用氣相色譜（GC）法檢測了不同儲(chǔ)存時(shí)間、不同工藝的黃酒中香蘭素的含量，通過相關(guān)性分析和回歸分析探討了儲(chǔ)存時(shí)間、前發(fā)酵最高溫度、麥曲添加量、發(fā)酵液料比對(duì)黃酒中香蘭素含量的影響。結(jié)果表明，黃酒中香蘭素含量和儲(chǔ)存時(shí)間有較高的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.906；黃酒中香蘭素含量和麥曲添加量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2為0.712；黃酒中香蘭素含量和前發(fā)酵最高溫度、發(fā)酵液料比呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.805、0.377。

黃酒；香蘭素；相關(guān)性

香蘭素（vanillin）又叫香草醛，是香蘭豆莢中的典型香氣物質(zhì)，由于其香氣愉悅，廣泛地應(yīng)用于食品、飲料、化妝品等領(lǐng)域中［1］。橡木桶儲(chǔ)存的葡萄酒中，香蘭素是重要的香氣物質(zhì)之一，主要來源于木質(zhì)素的降解［2］；而老化的特種啤酒中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4-VG）降解產(chǎn)生的香蘭素賦予啤酒特殊的香草氣息［3］。黃酒是中國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵酒，和葡萄酒、啤酒并稱世界三大古酒。黃酒發(fā)酵過程中糯米、麥曲在多種微生物的作用下形成了黃酒特有的香氣，一些黃酒中可以聞到巧克力的愉悅香味，經(jīng)檢測此種香氣主要含香蘭素所致。有研究表明香蘭素是黃酒的重要香氣物質(zhì)之一［4］。但是關(guān)于黃酒中香蘭素的來源及其生成機(jī)理鮮有報(bào)道。目前，香蘭素的檢測方法有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜（gas chromatography，GC）法、紫外光光度法、電化學(xué)法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）等［5-11］。針對(duì)黃酒的特點(diǎn)選用了一種簡單、快捷、準(zhǔn)確的香蘭素檢測方法，為探討黃酒中香蘭素的生成機(jī)理提供了基礎(chǔ)［12］。

研究表明，阿魏酸可在微生物的作用下轉(zhuǎn)化為香蘭素。而黃酒釀造中所使用的麥曲等原料中含有豐富的阿魏酸。分析不同的黃酒釀造工藝其主要的差異在于發(fā)酵最高溫度、麥曲添加量、發(fā)酵液料比。而有研究表明黃酒中香蘭素的含量和儲(chǔ)存時(shí)間也有相關(guān)性。本試驗(yàn)通過采用氣相色譜法對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)間、不同工藝的黃酒進(jìn)行分析，探討影響黃酒中香蘭素生成的主要因素，以期為生產(chǎn)過程中香蘭素含量的控制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃酒樣品：2年陳釀B工藝原酒、3年陳釀B工藝原酒、4年陳釀B工藝原酒、13年陳釀B工藝原酒、18年陳釀B工藝

表1　各工藝主要參數(shù)Table 1 Main parameters of various processes

香草醛（純度為99%）：上海阿拉丁（Aladdin）生化科技股份有限公司；乙醚（色譜純）：杭州大方化學(xué)試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

HYQ-3110型渦旋混勻器：美國精騏有限公司；MTN-2800D氮吹儀：北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司；Aglient 7890A氣相色譜儀（帶火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））：安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

吸取2mL酒樣于10mL的具塞試管中，55℃氮吹5min，加入2 mL乙醚，加蓋，渦旋振蕩2 min，靜置分層后取上清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)膜過濾，待GC檢測。

1.3.2氣相色譜檢測分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為19091N-577 HP-INNOWax（20 m×0.18 mm×0.18 μm）；進(jìn)樣口溫度250℃，不分流進(jìn)樣；載氣（氮?dú)猓┖懔魉? mL/min；升溫程序：柱箱起始溫度150℃，保持4 min，15℃/min升溫至200℃，保持15 min；檢測器溫度300℃；氫氣、空氣、尾吹流速分別為30 mL/min、400 mL/min、25 mL/min。

1.3.3香蘭素含量測定

準(zhǔn)確稱取一定量的香草醛標(biāo)準(zhǔn)樣品，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.45 μm有機(jī)膜過濾后經(jīng)GC檢測，對(duì)每個(gè)質(zhì)量濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)測定，以響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，香蘭素質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程為Y=11.489 88x+5.174 74，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，在0.1～20 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算黃酒樣品中香蘭素的含量。

1.3.4各因素對(duì)黃酒香蘭素含量的影響

不同工藝對(duì)黃酒香蘭素含量的影響：分別抽取3年陳釀的A、B、C、D工藝的黃酒樣品各5個(gè)，測定其香蘭素含量，每個(gè)酒樣平行測定3次；

不同儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)黃酒香蘭素含量的影響：取B工藝生產(chǎn)的黃酒樣品，儲(chǔ)藏時(shí)間分別為2年、3年、4年、13年、18年各5個(gè)，測定其香蘭素含量，每個(gè)酒樣平行測定3次；

麥曲添加量對(duì)黃酒香蘭素含量的影響驗(yàn)證試驗(yàn)：取按照B工藝釀造的黃酒，測定其香蘭素含量，與同條件下不添加麥曲的黃酒對(duì)照樣品進(jìn)行對(duì)比。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0相關(guān)性分析和線性分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品及黃酒樣品氣相色譜圖

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液和黃酒樣品的氣相色譜圖檢測結(jié)果見圖1。由圖1可以，香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品和黃酒樣品中的香蘭素峰分離效果良好，表明此方法適用于檢測黃酒中香蘭素含量。

圖1　香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（A）和黃酒樣品（B）氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of vanillin standard（A）and Chinese rice wine simple（B）

2.2不同工藝影響因子相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)所用A、B、C、D 4種工藝產(chǎn)品均采用傳統(tǒng)黃酒工藝釀制，有著相近的生產(chǎn)工藝，即操作流程為：浸米→蒸飯→落缸→開耙→前發(fā)酵→后發(fā)酵→壓榨→煎酒→成品，但工藝參數(shù)各有差別，導(dǎo)致最終產(chǎn)品質(zhì)量不相同，香蘭素含量也有較顯著差異，取同年份的A、B、C、D工藝原酒各5個(gè)，進(jìn)行香蘭素含量的檢測，綜合前發(fā)酵最高溫度、麥曲添加量、發(fā)酵液料比3個(gè)主要工藝參數(shù)差異進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2　不同工藝參數(shù)原酒香蘭素檢測結(jié)果Table 2 Content of vanillin in Chinese rice wine by different manufacturing technique

由表2可知，不同工藝的黃酒樣品香蘭素含量差異較明顯。但從表2已難以直觀地看出各因子對(duì)香蘭素含量之間的關(guān)系，通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson（N=20）相關(guān)性檢驗(yàn)，各因子相關(guān)性見表3。

表3　各因子相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Correlation test of different factors

由表3可知，前發(fā)酵最高溫度和麥曲添加量對(duì)香蘭素含量在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)，表明前發(fā)酵最高溫度和麥曲添加量與香蘭素含量相關(guān)性較強(qiáng)，發(fā)酵液料比的相關(guān)性略弱，但在0.05水平（雙側(cè)）上仍然顯著。

2.3儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)黃酒中香蘭素含量的影響

選取儲(chǔ)藏時(shí)間為2年、3年、4年、13年、18年的B工藝生產(chǎn)所得的黃酒樣品各5個(gè)進(jìn)行香蘭素含量的檢測及相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。

表4　儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)黃酒中香蘭素含量的影響Table 4 Effect of storage time on the vanillin content in Chinese rice wine

由表4可知，隨著儲(chǔ)存年份的增加香蘭素含量也呈較明顯的增加，經(jīng)SPSS 21.0軟件中Pearson（N=25）相關(guān)性檢驗(yàn)，儲(chǔ)存時(shí)間和香蘭素含量相關(guān)系數(shù)R2為0.906，在0.01（雙側(cè)）水平上顯著正相關(guān)。表明香蘭素含量和儲(chǔ)存時(shí)間相關(guān)性較高。

2.4部分回歸分析

將香蘭素含量設(shè)為因變量y，儲(chǔ)藏時(shí)間、前發(fā)酵最高溫度、麥曲用量、發(fā)酵液料比設(shè)為自變量x，對(duì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行部分線性回歸分析，結(jié)果見圖2。

圖2　各因素對(duì)香蘭素含量影響的線性回歸曲線Fig.2 Linear regression curve of effect of various factors on vanillin content

圖2為各因素和香蘭素含量趨勢圖，將坐標(biāo)軸進(jìn)行平移，坐標(biāo)軸數(shù)據(jù)均值設(shè)為（0，0），斜率為正代表正相關(guān)關(guān)系，斜率為負(fù)代表負(fù)相關(guān)關(guān)系。點(diǎn)集中在95%置信區(qū)間內(nèi)，線之間的截距越短表明相關(guān)性越高。由圖2可知，儲(chǔ)存時(shí)間的相關(guān)性較高，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.906，線性方程為y=0.243x+1.143；而前發(fā)酵溫度、麥曲添加量和發(fā)酵液料比由于3因子均有相關(guān)貢獻(xiàn)，R2相對(duì)較低，從曲線斜率可以看出前發(fā)酵溫度和發(fā)酵液料比對(duì)黃酒中香蘭素含量有負(fù)相關(guān)作用，而麥曲添加量和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)香蘭素含量有較顯著的正相關(guān)作用。

麥曲中含有豐富的阿魏酸，阿魏酸經(jīng)微生物作用可以轉(zhuǎn)化為香蘭素，所以隨著麥曲添加量的增多，阿魏酸含量也會(huì)增加，可轉(zhuǎn)換底物增加，這可能是香蘭素含量與麥曲添加量正相關(guān)的原因。在儲(chǔ)存過程中，酒也會(huì)發(fā)生變化，在陳化反應(yīng)過程中香蘭素生成，這可能是香蘭素含量與儲(chǔ)存時(shí)間正相關(guān)的原因。發(fā)酵液料比越大，發(fā)酵底物濃度越低，因此與香蘭素含量呈負(fù)相關(guān)；前發(fā)酵溫度可能影響了發(fā)酵過程微生物生長情況，與香蘭素含量呈負(fù)相關(guān)，但具體原因還需要進(jìn)一步探討和研究。

2.5麥曲添加量對(duì)香蘭素含量的驗(yàn)證試驗(yàn)

麥曲中由于含有較豐富的阿魏酸，部分霉菌能將阿魏酸作為底物轉(zhuǎn)化成香蘭素，是酒體中香蘭素生成的重要可能途徑之一［13-16］。在其他條件都相同的情況下，將不添加麥曲的兩個(gè)樣品M0-1和M0-2與正常添加麥曲（17%）的樣品B進(jìn)行比較，儲(chǔ)存2年后進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表5。

表5　黃酒中香蘭素含量Table 5 Content of vanillin in Chinese rice wine

由表5可知，正常添加麥曲的黃酒中香蘭素含量為1.365 mg/L，而不添加麥曲的黃酒中未檢測出香蘭素。與上述試驗(yàn)中香蘭素的含量和麥曲添加量呈正相關(guān)的結(jié)論相一致。且無麥曲的黃酒中未檢測出香蘭素，因此可初步斷定麥曲中含有黃酒中香蘭素生成的前體物質(zhì)。

3　結(jié)論

本研究采用氣相色譜法檢測了不同儲(chǔ)存時(shí)間、不同工藝（前發(fā)酵溫度、麥曲的添加量、發(fā)酵液料比）的黃酒中香蘭素的含量。使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和線性分析，結(jié)果表明，同品種同工藝黃酒中香蘭素含量和儲(chǔ)存時(shí)間有較高的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.906；麥曲添加量和黃酒中香蘭素含量也呈正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.712；不添加麥曲的2年陳釀黃酒中未檢測出香蘭素，而相同條件下添加17%麥曲的黃酒香蘭素含量為1.365 mg/L，符合麥曲添加量和黃酒中香蘭素含量正相關(guān)的結(jié)論，也可猜測麥曲是黃酒中香蘭素形成的關(guān)鍵來源之一；前發(fā)酵最高溫度、發(fā)酵液料比和黃酒中香蘭素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2分別0.805、0.377。發(fā)酵料液比對(duì)香蘭素含量的相關(guān)性較弱。通過研究黃酒儲(chǔ)存時(shí)間和加工工藝對(duì)香蘭素含量的相關(guān)性的研究，對(duì)黃酒生產(chǎn)工藝的調(diào)控有一定的指導(dǎo)作用。

［1］PRIEFER H，RABENHORST J，STEINBIJCHEL A.Production of vanillin［J］.Microbiol Biotechnol，2001，56：296-314.

［2］MORALES M L，BENITEZ B，TRINCOSO A M.Accelerated aging of wine vinegars with oak chips：evaluation of wood flavor compounds［J］. Food Chem，2004，88（2）：305-315.

［3］袁冬華，蔡國林，陸健.啤酒老化過程中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的降解和羅布麻酚與香草醛的形成［J］.啤酒科技，2010（7）：61-65.

［4］莫新良，徐巖，范文來.中國黃酒中香草醛的定性定量分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（12）：133-137.

［5］于加平，劉強(qiáng).高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的香蘭素［J］.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，14（2）：4-6.

［6］歐菊芳，顧秀英，鮑忠定，等.氣相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中香蘭素和乙基香蘭素［J］.江西科學(xué)，2011，29（1）：1-5.

［7］MEROPI T P，ANTONY C C.Chemilumino metric determination of vanillin in commercial vanillin products［J］.Talanta，2007，71（1）：208-212.

［8］OHASHI M，OMAE H，HASHIDA M，et al.Determination of vanillin and relate flavor compounds in cacoadrind by capillary electrophoresis［J］.J Chrom A，2007，1138（1-2）：262-267.

［9］BETTAZZI F，PALCHETTI I，SISALLI S，et al.A disposable electrochemical sensor for vanillin detection［J］.Anal Chim Acta，2006，555（1）：134 138.

［10］羅冠中，劉祥，孟云彩.液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法同時(shí)測定嬰幼兒配方食品中甲基香蘭素和乙基香蘭素［J］.分析試驗(yàn)室，2011，30（8）：84-87.

［11］韓雙，楊金寶，劉寧.氣相色譜-質(zhì)譜/選擇離子法測定牛奶中的香蘭素［J］.中國乳品工業(yè)，2008，36（8）：53-55.

［12］單之初，俞紅波，曹秀苗，等.一種酒中香蘭素的檢測方法：CN103499655A［P］.2014-01-08.

［13］許美玲.生物法合成香蘭素和香草酸的研究［D］.北京：北京化工大學(xué)，2007.

［14］鄭麗蓉.微生物轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香草醛的研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2006.

［15］鄭璞，鄭麗蓉，孫志浩，等.黑曲霉CGMCC0774和朱紅密孔菌CGMCC1115兩步轉(zhuǎn)化阿魏酸制備生物香蘭素［J］.生物加工過程，2005，3（3）：69-73.

［16］李士煉.香蘭素的生物轉(zhuǎn)化與提取工藝研究［D］.天津：天津科技大學(xué)，2005.

Influence factors of the content of vanillin in Chinese rice wine

SHAN Zhichu1，2，CHENG Fei1，2，SHEN Xiang1，2，CHEN Hanfeng3，YU Hongbo1，2，WEI Yixin1，2，PAN Xingxiang1，2*
（1.Zhejiang Pagoda Brand Shaoxing Rice Wine Co.，Ltd.，Shaoxing 312032，China；2.China Academy of Rice Wine and Traditional Fermentation Technology，Shaoxing 312032，China；3.Shaoxing City keqiao District Food Inspection Test Center，Shaoxing 312030，China）

Vanillin is one of important aroma compoents in Chinese rice wine.The content of vanillin in Chinese rice wine with different storage time and different process was determined by gas chromatography.Through correlation and regression analysis，the effects of storage time，the highest temperature of former fermentation，wheat koji addition and fermented liquid-solid ratio on the vanillin content were discussed.Results showed that the vanillin content in Chinese rice wine had a higher positive correlation with storage time，the correlation coefficientR2was 0.906.The content had positive correlation with wheat koji addition，the correlation coefficientR2was 0.712.The content had negative correlation with the highest temperature of former fermentation and fermented liquid-solid ratio，the correlation coefficientR2were 0.805 and 0.377，respectively.

Chinese rice wine；vanillin；correlation

TS261.1

0254-5071（2016）09-0077-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.018

手工黃酒中香蘭素生成機(jī)理研究（KYZX2014001）

單之初（1981-），男，工程師，本科，主要從事黃酒釀造機(jī)理、黃酒成分檢測的研究工作。

潘興祥（1963-），男，高級(jí)工程師，本科，主要從事黃酒發(fā)酵工藝、黃酒釀造機(jī)理的研究工作。原酒、3年陳釀A工藝原酒、3年陳釀C工藝原酒、3年陳釀D工藝原酒不同批次各5個(gè)平行樣品，3年陳釀B工藝不加麥曲酒2個(gè)樣品：浙江塔牌紹興酒有限公司。不同黃酒的主要工藝參數(shù)見表1。

2016-03-18