張振坤，王玉嬌，霍玲玲，袁小轉(zhuǎn)，孫　瑩，吳建峰*

（1.江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 漣水 223400；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210000）

一株產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌的分離鑒定與產(chǎn)酶特性

張振坤1，2，王玉嬌1，霍玲玲1，袁小轉(zhuǎn)1，孫瑩1，吳建峰1*

（1.江蘇今世緣酒業(yè)股份有限公司，江蘇 漣水 223400；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210000）

從大曲中分離到一株產(chǎn)纖溶酶的芽孢桿菌，命名為B4。該菌革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體桿狀，專(zhuān)性好氧，能夠利用甲醇作唯一碳源。通過(guò)形態(tài)特征觀察、生理生化特性并結(jié)合基于16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株B4為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。該菌最適生長(zhǎng)溫度為35℃，最適發(fā)酵初始pH值為7.0，發(fā)酵42 h酶活力最高可達(dá)649 U/mL。

大曲；纖溶酶；甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌；鑒定；產(chǎn)酶特性

血栓是一種常見(jiàn)的心腦血管類(lèi)疾病。鏈激酶（streptokinase，SK）、尿激酶（urokinase，UK）、葡激酶（staphylokinase，SAK）等是臨床上治療該類(lèi)疾病的常用藥物，但這些藥物存在著特異性差、半衰期短、需大劑量連續(xù)用藥等缺點(diǎn)［1-2］。1987年日本學(xué)者從納豆中分離到一種高效纖溶酶——納豆激酶［3］，引起了各界的廣泛關(guān)注，產(chǎn)蛋白酶微生物成為重要的產(chǎn)纖溶酶潛在菌種。此后國(guó)內(nèi)外研究人員先后從豆豉、豆醬、魚(yú)蝦醬等材料中分離到多株具有產(chǎn)纖溶酶能力的菌株，這些菌株絕大多數(shù)屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）及其近緣種群［4-6］。

目前研究篩選纖溶酶產(chǎn)生菌多以高蛋白發(fā)酵食品為對(duì)象，較少涉及其他材料。大曲是一種傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵酶制劑，是白酒釀造過(guò)程中微生物和酶的主要來(lái)源。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的培養(yǎng)篩選，大曲中富集了多種產(chǎn)酶性能優(yōu)良的微生物，其中包括大量產(chǎn)中性或堿性蛋白酶的芽孢桿菌，其所產(chǎn)蛋白酶一般具有活力較高、溫度耐受性較強(qiáng)等特性［7-8］。本研究以釀酒大曲這一傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵酶制劑為材料，分離其中的芽孢桿菌，采用酪蛋白平板法初篩、瓊脂糖-纖維蛋白平板法復(fù)篩，篩選產(chǎn)纖溶酶能力較強(qiáng)的芽孢桿菌，為挖掘大曲微生物資源、開(kāi)發(fā)高效的纖溶酶提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1大曲及試劑

分菌樣品中高溫大曲：今世緣酒業(yè)股份有限公司；牛纖維蛋白原、凝血酶（430 U/瓶）、尿激酶（1 240 U/支）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；擴(kuò)增引物27F、1492R：上海生工生物工程有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

斜面與平板培養(yǎng)基采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸出粉3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂粉20.0g/L，121℃滅菌15 min。

酪素培養(yǎng)基：葡萄糖1.0g/L，酵母膏1.0g/L，酪素5.0g/L，K2HPO41.0g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO40.5g/L，瓊脂15.0g/L，pH7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，K2HPO44.0 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設(shè)備

GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HHS214電熱恒溫水浴鍋：江蘇省醫(yī)療器材廠；SHZ-82恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；BX-41顯微鏡：日本OLYMPUS公司；KGSX500高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司；GelDoc2000凝膠成像儀：美國(guó)BIO-RAD公司；UV-2550分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌種的分離與篩選

大曲用無(wú)菌研缽研碎，取10 g放入無(wú)菌三角瓶，加入90mL無(wú)菌水，搖床振蕩30min后將三角瓶置于80℃水浴鍋中保溫10min。取1mL菌液逐級(jí)稀釋?zhuān)總€(gè)梯度吸取0.1mL涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37℃條件下培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形狀、大小、表面形態(tài)等特征挑取不同的單菌落多次劃線獲得純培養(yǎng)［9］。

粗酶液的制備［10］：將分離獲得的純培養(yǎng)采用稀釋涂布法涂布酪素培養(yǎng)基平板，挑取有明顯溶解圈的菌落接入試管并編號(hào)保藏。初篩得到的菌種挑取一環(huán)分別接入種子培養(yǎng)基，37℃條件下150 r/min培養(yǎng)18 h，按照4%接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基（裝液量60 mL/250 mL）中振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min得粗酶液。

菌種篩選：凝血酶和纖維蛋白原作用生成交聯(lián)纖維蛋白，呈乳白色，不透明。交聯(lián)纖維蛋白被纖溶酶分解后乳白色消失，在瓊脂糖-纖維蛋白平板上形成半透明的溶解圈，以溶解圈的大小反映纖溶酶活力。制作的瓊脂糖-纖維蛋白平板，用直徑3 mm的打孔器打孔［11］。用微量進(jìn)樣器吸取10 μL粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白平板上的孔中，同時(shí)以不接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基離心上清液作空白對(duì)照，以尿激酶溶液作陽(yáng)性對(duì)照，于37℃條件下溫育并觀察記錄溶解圈情況。

1.3.2纖溶酶活力測(cè)定

瓊脂糖-纖維蛋白平板法是測(cè)定尿激酶、蚓激酶、納豆激酶等纖溶酶活力的常用方法，纖溶酶活力通常以已知活力值的尿激酶來(lái)衡量。將尿激酶溶液梯度稀釋?zhuān)?24 U/mL、248 U/mL、496 U/mL、744 U/mL、992 U/mL、1240 U/mL），各取10 μL點(diǎn)樣于瓊脂糖-纖維蛋白平板上，于37℃條件下溫育15 h后用游標(biāo)卡尺測(cè)量溶解圈垂直的兩個(gè)直徑，以溶解圈面積（以互相垂直的兩直徑之積表示，下同）為橫坐標(biāo)，以尿激酶活力為縱坐標(biāo)繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。同時(shí)測(cè)定樣品的溶解圈面積，按照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程計(jì)算出纖溶酶活力［12］。

1.3.3形態(tài)觀察與生理生化鑒定

將分離菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，37℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)并拍照；參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13］中芽孢桿菌屬鑒別特征選擇生理生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行初步鑒定。結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果參照相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)分離菌株作進(jìn)一步鑒定［14］。

1.3.4菌株基于16S rDNA的分子生物學(xué)鑒定［9，15］

菌株基因組的提取與16S rDNA的擴(kuò)增：用煮沸法提取的菌株脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）作為模板，采用通用引物27F和1492R進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工測(cè)序。16S rDNA序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：將測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行基本局部聯(lián)配搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源序列比對(duì)分析，下載同源性高的模式菌株16S rDNA序列，與試驗(yàn)菌株的序列一起用ClustalX1.8和MEGA4.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.5菌株B4產(chǎn)纖溶酶條件

最適產(chǎn)酶溫度：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測(cè)定溶解圈面積。最適產(chǎn)酶pH：發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，于最適溫度下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測(cè)定溶解圈面積。生長(zhǎng)曲線及最佳產(chǎn)酶時(shí)間：在最適溫度、最適pH條件下培養(yǎng)，每隔6 h取發(fā)酵液按照1.3.1所述方法制備粗酶液并測(cè)定溶解圈面積，并以未接菌的培養(yǎng)基做參比測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的OD600nm值。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌的分離篩選

用酪蛋白平板法初篩得到菌株9株，采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法對(duì)上述菌株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，有7株菌的粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產(chǎn)生溶解圈，其編號(hào)分別為A3、B2、B4、B6、B7、B8和C6。

圖1　粗酶液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產(chǎn)生的溶解圈Fig.1 Lysis zone of the crude enzyme on agarose-fibrin plates

尿激酶活力與其在纖維蛋白平板上的溶解圈面積呈線性關(guān)系，實(shí)驗(yàn)得其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.824x-875.9，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 0。按照回歸方程計(jì)算各菌株發(fā)酵液的纖溶活性，結(jié)果如表1所示。由表1可知，菌株B4產(chǎn)纖溶酶活力最高，為524 U/mL。菌株B7、菌株B2及菌株B6產(chǎn)纖溶酶活力分別為494 U/mL、436 U/mL、380 U/mL，而菌株A3、菌株B8及菌株C6產(chǎn)纖溶酶活力較低（＜124 U/mL）。因此，選擇菌株B4用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1　分離菌株產(chǎn)纖溶酶活力的比較Table 1 Comparison of fibrinolytic enzyme activity produced by isolated strains

2.2菌株B4形態(tài)特征

菌株B4的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　菌株B4的菌落形態(tài)（A）與革蘭氏染色（B）Fig.2 Colony morphology（A）and gram staining（B）of strain B4

由圖2A可知，菌株B4的菌落近圓形，直徑4～8 mm，扁平，邊緣有缺刻，表面干燥，呈灰白色。由圖2B可知，菌株B4的革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體桿狀。

2.3菌株B4生理生化特性

按照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中芽孢桿菌屬鑒別特征，選擇生理生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiology and biochemistry experiments

由表2可知，菌株B4能夠分解酪素和淀粉，液化明膠，V-P測(cè)定與觸酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，專(zhuān)性好氧，可以利用檸檬酸鹽，不能利用丙酸鹽，發(fā)酵D-木糖、D-甘露醇產(chǎn)酸，能夠利用甲醇作唯一碳源。形態(tài)特征與生理生化特性符合文獻(xiàn)中關(guān)于枯草芽孢桿菌及其近源種的描述［13］。

2.4菌株B4的分子生物學(xué)鑒定

選擇產(chǎn)纖溶酶活最高的菌株B4進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，提取菌株B4基因組DNA，將得到的基因組作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為1500bp左右。

圖3　菌株B4 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR amplification products electrophoresis of 16S rDNA of strain B4

將菌株B4的16S rDNA序列信息遞交到GenBank上獲得登錄號(hào)KU059179。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株B4與枯草芽孢桿菌亞種及其近緣種同源性較高，其中與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）的同源性最高，達(dá)到99.38%。下載同源性高于97%的前14株菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株B4與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌聚為一支且自展值達(dá)到95，與文獻(xiàn)中關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌生理生化特性和形態(tài)特征的報(bào)道一致［14］，因此將菌株B4鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

圖4　基于16Sr DNA構(gòu)建的株菌B4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain B4 based on the 16S rDNA

2.5菌株B4的產(chǎn)酶特性分析

2.5.1發(fā)酵溫度對(duì)菌株B4產(chǎn)酶的影響

由圖5可知，發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，溶解圈面積最大，溫度過(guò)低或過(guò)高酶活性均有所下降，尤其發(fā)酵溫度＞35℃時(shí)，溶解圈面積下降明顯。發(fā)酵溫度＜35℃不利于B4的生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶量少；而發(fā)酵溫度過(guò)高容易導(dǎo)致纖溶酶失活。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為35℃。

圖5　發(fā)酵溫度對(duì)菌株B4產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain B4

2.5.2初始pH對(duì)菌株B4產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，培養(yǎng)基初始pH值為7.0時(shí)，溶解圈面積最大，說(shuō)明中性條件有利于菌株B4產(chǎn)酶，初始pH＜6.5或＞7. 5均對(duì)菌株B4產(chǎn)酶不利。因此，最佳初始pH值為7.0。

圖6　初始pH對(duì)菌株B4產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on enzyme production of strain B4

2.5.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株B4產(chǎn)酶的影響

圖7　發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株B4生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the growth and enzyme production of strain B4

由圖7可知，菌體生長(zhǎng)的延滯時(shí)間很短，接種后很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵至第18小時(shí)時(shí)菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期，24 h后進(jìn)入衰退期。接種后0～6 h無(wú)溶解圈產(chǎn)生，從第6小時(shí)開(kāi)始大量產(chǎn)生纖溶酶，18 h后產(chǎn)酶速率趨緩，至第42小時(shí)發(fā)酵液中溶解圈面積達(dá)到最高，此后酶活力逐漸下降?？芍闎4發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，產(chǎn)酶滯后于菌體生長(zhǎng)。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為42 h。

3　結(jié)論

采用酪蛋白平板法初篩、瓊脂糖-纖維蛋白平板法復(fù)篩，從釀酒大曲中分離到一株產(chǎn)纖溶酶活力較高的芽孢桿菌B4。對(duì)菌株B4進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和生理生化試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行16SrDNA序列比對(duì)并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將菌株B4鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。產(chǎn)酶特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌最適產(chǎn)酶溫度為35℃，最適初始pH值為7.0，發(fā)酵42 h產(chǎn)酶活力最高為649 U/mL。

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Isolation and identification of a fibrinolytic enzyme-producingBacillusand its enzyme-production characteristics

ZHANG Zhenkun1，2，WANG Yujiao1，HUO Lingling1，YUAN Xiaozhuan1，SUN Ying1，WU Jianfeng1*
（1.JiangSu King's Luck Brewery Co.，Ltd.，Lianshui 223400，China；2.College of Biological and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 210000，China）

A fibrinolytic enzyme-producingBacillusnamed B4 was isolated fromDaqu.The strain was a Gram-positive，rod-shaped，obligate aerobic bacterium and could use methanol as sole carbon source.According to morphology observation，physiological-biochemical characteristic and phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequence，the strain B4 was identified asBacillus methylotrophicus.The optimum growth temperature of strain B4 was 35℃，the optimum fermentation initial pH was 7.0 and fermentation time was 42 h.Under the conditions，the fibrinolytic enzyme activity could be up to 649 U/ml.

Daqu；fibrinolytic enzyme；Bacillus methylotrophicus；identification；enzyme-production characteristics

Q939.9

0254-5071（2016）09-0064-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.015

2016-05-05

張振坤（1985-），男，助理工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。

吳建峰（1966-），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)獒劸瓶茖W(xué)。