李媛睿， 劉婧嫻， 俞 靜， 陳 峰， 劉 瑛

·論著·

應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南的水解能力

李媛睿， 劉婧嫻， 俞 靜， 陳 峰， 劉 瑛

目的 應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）檢測(cè)產(chǎn)KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1與IMP-4型碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌水解厄他培南的能力。 方法 收集2009年6月－2013年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院各種臨床標(biāo)本中分離的耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌（CRE），用改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶的表型篩選，用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)其碳青霉烯酶基因，并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。應(yīng)用MALDI-TOF MS進(jìn)行厄他培南水解預(yù)試驗(yàn)以確定最適厄他培南濃度及孵育時(shí)間，隨后采用預(yù)試驗(yàn)中的最適條件，應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測(cè)CRE水解厄他培南的能力。結(jié)果 108株CRE中，有102株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性，其中90株產(chǎn)KPC-2、4株產(chǎn)NDM-1、3株產(chǎn)VIM-2、2株產(chǎn)IMP-1、2株產(chǎn)IMP-4、1株同時(shí)產(chǎn)KPC-2和IMP-4型碳青霉烯酶，且在2 h內(nèi)均能水解厄他培南；另外6株CRE改良Hodge試驗(yàn)陰性，未檢測(cè)出上述碳青霉烯酶基因，且不水解厄他培南。結(jié)論 臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用MALDI-TOF MS能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)CRE水解厄他培南的能力，篩查產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌，為臨床早期合理使用碳青霉烯類(lèi)抗生素提供依據(jù)。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜； 產(chǎn)碳青霉烯酶； 腸桿菌科細(xì)菌； 厄他培南； 水解能力

碳青霉烯類(lèi)抗生素是20世紀(jì)80年代新研發(fā)出的一組廣譜β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌的最后選擇［1］。隨著該類(lèi)藥物的廣泛使用，美國(guó)National Healthcare Safety Network（NHSN）、歐洲European Antimicrobial Resistance Surveillance Network （EARS-Net）和CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果均顯示，耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌（CRE）逐漸開(kāi)始在全球蔓延［2-4］，它引起的感染難以治療、死亡率高，已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生威脅［1］。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的主要原因之一是產(chǎn)生碳青霉烯酶，目前已發(fā)現(xiàn)近100種碳青霉烯酶［5］。因此，快速準(zhǔn)確檢測(cè)碳青霉烯酶顯得尤為重要與迫切?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)用于檢測(cè)細(xì)菌水解抗生素能力已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌水解厄他培南能力的方法，旨在快速篩查產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集2009年6月－2013年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室各種臨床標(biāo)本分離得到的CRE，剔除同一患者相同部位分離的重復(fù)菌株，于-80℃甘油肉湯中保存。另外收集7株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感的臨床分離株（肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、大腸埃希菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌各1株）。肺炎克雷伯菌ATCC 700603及大腸埃希菌ATCC 25922由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 厄他培南粉劑（中國(guó)，杭州默沙東公司），美羅培南及厄他培南藥敏紙片（英國(guó)，OXOID公司），血瓊脂平皿、麥康凱平皿、MH瓊脂平皿（中國(guó)，上海伊華公司），VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)和AST-GN13藥敏卡片（法國(guó)，Bio Mérieux公司）；Mastercycler Epgradient PCR儀（德國(guó)，Eppendorf公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（中國(guó)，大連寶生物工程有限公司），PCR引物（中國(guó)，上海生工生物工程公司），ABI Prism 310 Genetic Analyzer測(cè)序儀及BigDye Terminator v3.1測(cè)序試劑盒（美國(guó)，Applied Biosystems公司），水平電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)（中國(guó)，上海天能公司），Microflex LT MALDI-TOF MS儀、基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）和Anchorchip 96靶板（德國(guó)，Bruker Daltonik公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定、藥敏及改良Hodge試驗(yàn) 凍存菌種復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)種于血瓊脂平皿，35℃孵育18～24 h，用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定。用VITEK-2 Compact儀聯(lián)合藥敏紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2012 版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［6］，并依據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心于2012年頒布的耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌控制指南篩選出CRE菌株［7］。用改良Hodge試驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)碳青霉烯酶的表型篩選，試驗(yàn)方法與結(jié)果判斷參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 采用PCR方法對(duì)108株CRE進(jìn)行blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaGES和blaOXA碳青霉烯酶基因擴(kuò)增。PCR引物序列、反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)［8-10］。對(duì)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物基因測(cè)序，具體反應(yīng)體系與操作流程見(jiàn)參考文獻(xiàn)［11］，測(cè)序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析，確定其基因亞型。

1.2.3 MALDI-TOF MS檢測(cè)預(yù)試驗(yàn) 選取10株CRE為預(yù)試驗(yàn)研究對(duì)象，包括2株大腸埃希菌（分別產(chǎn)KPC-2、NDM-1），3株肺炎克雷伯菌（分別產(chǎn)KPC-2、NDM-1、IMP-4），3株陰溝腸桿菌（1株產(chǎn)IMP-1，2株產(chǎn)VIM-2），不產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌各1株。肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922各1株作為陰性對(duì)照。將40 mmol/L Tris-HCl溶液與0.9% NaCl溶液等體積混合，加入不同量的厄他培南粉劑，使其終濃度分別為0.05 g/L、0.1 g/L、0.25 g/ L及0.5 g/L。吸取不同濃度的厄他培南溶液500 μL分別至4個(gè)EP管中，用無(wú)菌槍頭挑取血平皿上的純菌落，配成4 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海抗芗尤?0.0 % SDS 0.5 μL。35℃孵育1 h后，各管取150 μL菌懸液，12 000 g離心2 min，吸取上清液0.7 μL點(diǎn)樣至Anchorchip 96靶板，晾干后覆蓋點(diǎn)樣3.3 g/L的HCCA基質(zhì)0.7 μL，待靶板上液滴晾干后進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。以相同操作步驟，再取孵育2 h和3 h后的上清液點(diǎn)樣?？瞻讓?duì)照為同體系同濃度的厄他培南溶液。利用flexAnalysis 3.3軟件比對(duì)分析質(zhì)譜圖，篩選出最適厄他培南濃度及孵育時(shí)間。

1.2.4 MALDI-TOF MS檢測(cè)批次試驗(yàn) 應(yīng)用MALDI-TOF MS分批次檢測(cè)CRE及碳青霉烯類(lèi)敏感腸桿菌科細(xì)菌水解厄他培南能力，批次試驗(yàn)中厄他培南溶液濃度及孵育時(shí)間均參照預(yù)試驗(yàn)中最適條件。質(zhì)譜儀主要參數(shù)設(shè)置：采用線(xiàn)性正離子模式，離子源電壓1為20 kV，離子源電壓2為18 kV，離子源透鏡電壓6 kV，脈沖離子引出時(shí)間為100 ns，檢測(cè)質(zhì)量范圍0～1 000 Da，激光衰減器偏置20 %，激光衰減器范圍30 %，激光強(qiáng)度65 %～75 %。質(zhì)量控制：使用HCCA基質(zhì) （190 Da的［M+H］+峰，380 Da的 ［2M+H］+）和厄他培南（497 Da 的［M+Na］+峰）進(jìn)行定標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 鑒定、藥敏試驗(yàn)及改良Hodge試驗(yàn)

復(fù)蘇菌株的MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與原鑒定結(jié)果一致。根據(jù)菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，篩選出108株CRE，其中肺炎克雷伯菌75株，產(chǎn)氣腸桿菌17株，大腸埃希菌5株，陰溝腸桿菌5株，弗勞地枸櫞酸桿菌3株，產(chǎn)酸克雷伯菌2株，解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌1株。對(duì)108株CRE菌株進(jìn)行了改良Hodge試驗(yàn)，結(jié)果顯示102株陽(yáng)性。藥敏試驗(yàn)及改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 117株腸桿菌科細(xì)菌的特征Table1 Characterization of 117 strains of Enterobacteriaceae bacteria

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

102株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性CRE均攜帶不同類(lèi)型的碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-290株、blaNDM-14株、blaVIM-23株、blaIMP-12株、blaIMP-42株、同時(shí)攜帶blaKPC-2和blaIMP-41株；6株改良Hodge試驗(yàn)陰性CRE未檢出上述碳青霉烯酶基因。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 MALDI-TOF MS檢測(cè)結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，8株產(chǎn)碳青霉烯酶CRE的厄他培南水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性，在35℃條件下孵育2 h后，厄他培南為0.1 g/L時(shí)的質(zhì)譜峰明顯下降，其水解產(chǎn)物質(zhì)譜峰明顯升高，在該條件下能夠快速準(zhǔn)確地判斷水解結(jié)果；當(dāng)厄他培南濃度為0.05 g/ L時(shí)，抗生素峰本身峰強(qiáng)度低，孵育后其質(zhì)譜峰強(qiáng)度更低，難以被檢測(cè)；當(dāng)厄他培南濃度為0.25 g/L或0.5 g/L時(shí)，孵育2 h后抗生素峰下降不顯著，需延長(zhǎng)孵育時(shí)間至3～5 h，不利于快速得到結(jié)果。此外，2株不產(chǎn)碳青霉烯酶CRE、肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922的厄他培南水解試驗(yàn)均為陰性，孵育后厄他培南的質(zhì)譜峰無(wú)明顯變化。預(yù)試驗(yàn)中1株產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌在不同濃度厄他培南溶液中孵育2 h的質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 空白對(duì)照、陰性對(duì)照及1株產(chǎn)KPC-2肺炎克雷伯菌在厄他培南不同濃度下孵育2 h的質(zhì)譜圖Figure 1 MALDI-TOF MS spectra of ertapenem solution at different concentrations for blank control， negative control and one KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strain in 2 hours

應(yīng)用MALDI-TOF MS批量測(cè)試腸桿菌科細(xì)菌水解厄他培南能力，產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE與厄他培南共同孵育2 h后，497 Da的［M+Na］+和519 Da的［M +2Na］+抗生素峰明顯下降，471 Da的［Mhydr/decarb+Na］+和537 Da的［Mhydr+2Na］+抗生素水解/脫羧產(chǎn)物峰明顯升高，而493 Da的［Mhydr+H］+和515 Da的［Mhydr+Na］+抗生素水解產(chǎn)物峰稍微升高。不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE與碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感的腸桿菌科細(xì)菌與陰性對(duì)照質(zhì)譜峰一致。CRE在0.10 g/L濃度厄他培南孵育2 h后厄他培南的水解情況見(jiàn)圖1。

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制主要有：①產(chǎn)生碳青霉烯酶；②產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶伴隨外膜蛋白缺失；③外排泵系統(tǒng)上調(diào)，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是最重要的耐藥機(jī)制。目前用于檢測(cè)碳青霉烯酶的方法有：改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)、分光光度法、PCR擴(kuò)增及測(cè)序等。改良Hodge試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，但需要孵育過(guò)夜才能初步判斷產(chǎn)酶情況，檢測(cè)可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性［12］；Carba NP試驗(yàn)需要特殊試劑裂解細(xì)菌抽提細(xì)菌總蛋白，檢測(cè)也可能存在假陰性［13］；分光光度法操作繁瑣，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)［14］；PCR方法檢測(cè)的特異度高，但該檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)要求較高［15］。

MALDI-TOF MS技術(shù)操作方法日臻成熟，它不但在鑒定臨床微生物中有廣泛應(yīng)用，而且在細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究中也有所突破［16-18］。有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用MALDI-TOF MS能快速檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌［16，19］，其檢測(cè)原理為：細(xì)菌與抗生素共同孵育，細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶裂解碳青霉烯類(lèi)抗生素的β內(nèi)酰胺環(huán)和產(chǎn)生的抗生素水解產(chǎn)物可被MALDI-TOF MS檢測(cè)，從而篩選出產(chǎn)碳青霉烯酶的細(xì)菌。

本研究在大批量MALDI-TOF MS試驗(yàn)前進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，建立了適合本實(shí)驗(yàn)室的厄他培南水解實(shí)驗(yàn)方案，篩選出最適厄他培南濃度和孵育時(shí)間，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［20］，可能有兩方面原因：①本研究中挑取過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌至40 mmol/L Tris-HCl和0.9% NaCl混合溶液，配成4個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?；其他相關(guān)研究將細(xì)菌挑至0.45% NaCl溶液中，同樣配成4個(gè)麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，兩試?yàn)的菌液濃度一致。②產(chǎn)KPC-2、NDM-1、VIM-2、IMP-1或IMP-4型碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南的水解能力相近，在適宜的溶液環(huán)境中（如40 mmol/L Tris-HCl和0.9% NaCl混合溶液，或者0.45% NaCl溶液）均能快速水解厄他培南。本研究中觀察到質(zhì)譜圖497 Da的［M +Na］+和519 Da的［M +2Na］+抗生素峰明顯下降，471 Da的［Mhydr/decarb+Na］+和537 Da的［Mhydr+2Na］+抗生素水解/脫羧產(chǎn)物峰明顯升高，表示細(xì)菌水解厄他培南。產(chǎn)碳青霉烯酶CRE與0.1 g/L厄他培南溶液共同孵育2 h后，產(chǎn)碳青霉烯酶CRE均水解厄他培南，其余腸桿菌科細(xì)菌不能水解厄他培南，因此，可以推斷出CRE水解厄他培南的能力與產(chǎn)碳青霉烯酶相關(guān)。

MALDI-TOF MS主要用于檢測(cè)大分子化合物，在檢測(cè)小分子抗生素時(shí)可能受到雜質(zhì)干擾，由于十二烷基硫酸鈉 （SDS）不僅能有效抑制基質(zhì)信號(hào)［21］，而且降低了Tris-HCl與NaCl緩沖液上清液中細(xì)菌蛋白豐度［22］，本研究加入適量SDS至緩沖液提高了檢測(cè)特異性。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)還采用了AnchorChip靶板，其表面疏水作用基團(tuán)的中央具有親水基團(tuán)，溶劑蒸發(fā)時(shí)樣品液滴收縮增加了抗生素豐度，相對(duì)常規(guī)靶板靈敏度提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)［23］，提高了檢測(cè)的敏感性。

相對(duì)于常規(guī)碳青霉烯酶檢測(cè)方法，MALDITOF MS法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌厄他培南的水解能力有諸多優(yōu)點(diǎn)：①檢測(cè)速度快，2 h內(nèi)即可得到細(xì)菌是否產(chǎn)碳青霉烯酶結(jié)果；②能夠檢測(cè)產(chǎn)不同類(lèi)型碳青霉烯酶CRE水解厄他培南能力，包括KPC-2、 NDM-1、VIM-2、IMP-1和IMP-4等；③檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，攜帶碳青霉烯酶基因的CRE均水解厄他培南，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［20，24］；④操作簡(jiǎn)單，試劑用量少。但是該技術(shù)也存在局限性，僅能檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌是否水解碳青霉烯類(lèi)抗生素，能否檢測(cè)其他耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究利用MALDI-TOF MS檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌對(duì)厄他培南的水解能力，建立了適合本實(shí)驗(yàn)室快速、經(jīng)濟(jì)和高效的檢測(cè)方法，有利于快速篩查產(chǎn)碳青霉烯酶CRE，推斷其對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥性，對(duì)指導(dǎo)臨床早期進(jìn)行合理的抗生素治療，控制醫(yī)院內(nèi)產(chǎn)碳青霉烯酶CRE傳播有重要意義。

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Application of MALDI-TOF mass spectrometry to determine the ertapenemhydrolyzing ability in carbapenemases-producing Enterobacteriaceae

LI Yuanrui， LIU Jingxian， YU Jing， CHEN Feng， LIU Ying.
（Department of Laboratory Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Objective To determine the ability of KPC-2， NDM-1， VIM-2， IMP-1 and IMP-4 producing Enterobacteriaceae to hydrolyze ertapenem using matrix assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） system. Methods Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） isolates were collected from a variety of clinical specimens in Xinhua Hospital Affliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， from June 2009 to December 2013. Modifed Hodge test was performed to screen phenotype of carbapenemase production， and carbapenemase genes were detected by PCR amplifcation with sequencing analysis. A MALDI-TOF MS-based assay was set up to investigate the ability of CRE to hydrolyze ertapenem under the optimal concentration of ertapenem and incubation time， which were determined in preliminary experiment. Results Of the 108 CRE isolates， 102 were positive for modifed Hodge test， including 90 strains producing KPC-2， 4 strains NDM-1， 3 strains VIM-2， 2 strains IMP-1， 2 strains IMP-4， 1 strains both KPC-2 and IMP-4 carbapenemase. All the carbapenemase-producing Enterobacteriaceae strains could hydrolyze ertapenem in 2 hours. Other 6 CRE strains were negative for modified Hodge test，in which carbapenemase gene were not detected and they did not hydrolyze ertapenem. Conclusions In clinical microbiology laboratory， MALDI-TOF MS is rapid and accurate for determining ertapenem-hydrolyzing ability， which is useful for screeningcarbapenemases-producing Enterobacteriaceae， and guiding rational carbapenems use at early stage of infection.

matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry； carbapenemasesproducing； Enterobacteriaceae； ertapenem； hydrolytic ability

R378.2

A

1009-7708 （ 2016） 05-0608-06

10.16718/j.1009-7708.2016.05.014

2015-08-26

2015-11-18

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床微生物室，上海 200092。

李媛睿（1990—），女，碩士研究生，主要從事微生物耐藥性檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用研究。

劉瑛，E-mail：lywjw0129@163.com。