劉曉寧

摘要[目的]驗(yàn)證制備新方法所獲得的穩(wěn)定hpRNA是否可用于RNAi載體的構(gòu)建并達(dá)到基因表達(dá)干擾的效果。[方法]利用制備新方法（2 μL DNA與8 μL H2O混勻，95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min）制備hpRNA，后采用REGS方法構(gòu)建ZmMDAR RNAi載體，通過(guò)Grx1roGFP2和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)干擾的效果。[結(jié)果]利用制備新方法制備50 nt hpRNA。ZmMDAR基因的表達(dá)量變化和GrxlroGFP2探針的熒光比值變化表明hpRNA介導(dǎo)的干擾載體引起了原生質(zhì)體氧化還原狀態(tài)的變化。[結(jié)論]通過(guò)制備新方法所制備的hpRNA為RNAi載體所介導(dǎo)的干擾作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞發(fā)夾RNA；REGS；ZmMDAR RNAi；Grx1roGFP2

中圖分類號(hào)Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-175-03

A Prepared Method of hpRNA and Its Application for RNAi Vector

LIU Xiaoning（Medical College，Huanghe S&T College， Zhengzhou， Henan 450063）

Abstract[Objective] The aim was to test a method if it is applied for the RNAi vector and lead to interference effect. [Method] We prepared hpRNA by the new method （2 μL DNA and 8 μL H2O mixed， 95 ℃， 5 min， 37 ℃，15 min）， constructed ZmMDAR RNAi vector with REGS method， and tested the interference effect of gene expression by Grx1roGFP2 and realltime PCR. [Result] Using new method for preparing 50nt hpRNA， change of Zm MDAR expression and fluorescence ratio of GrxlroGFP2 indicated that hpRNA mediated interference vector caused the change of redox state of protoplast. [Conclusion] The prepared hpRNA by new method will lay a foundation for interference effect mediated by RNAi vector.

Key wordshpRNA； REGS； ZmMDAR RNAi； Grx1roGFP2

RNAi（RNA interference，RNA干擾）是一種進(jìn)化上保守的抵御靶向細(xì)胞和病毒mRNAs的dsRNA防御機(jī)制，在此生物學(xué)過(guò)程中，小RNA干擾了mRNA轉(zhuǎn)錄本水平，從而最終抑制該基因的表達(dá)。非編碼小RNAs是miRNA和siRNA的dsRNA前體裂解產(chǎn)物，此裂解過(guò)程是通過(guò)一種Dicer的核酸酶執(zhí)行完成。這些非編碼小RNAs與RISC[1]、AGO蛋白和其他效應(yīng)子蛋白共同導(dǎo)致了RNA干擾。

RNAi技術(shù)日趨成為一種功能基因組研究的重要手段，Sugao等[2]使用cDNA文庫(kù)構(gòu)建了RNAi文庫(kù)；Dietzl等[3]對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行單獨(dú)構(gòu)建UASIR載體，然后形成RNAi文庫(kù)的方法構(gòu)建了果蠅RNAi庫(kù)。此外，RNAi更有利于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的鑒定，利用RNAi文庫(kù)靶向人類基因組中的mRNA，最終鑒定了p53信號(hào)通路的5個(gè)新調(diào)節(jié)者。構(gòu)建RNAi文庫(kù)是一個(gè)相對(duì)較繁瑣的過(guò)程，迄今為止人們相繼發(fā)展了幾種構(gòu)建RNAi文庫(kù)的方法：Sen等[5]利用REGS方法構(gòu)建了鼠胚胎RNAi文庫(kù)；Luo等[6]利用DNA酶學(xué)工程方法構(gòu)建了小鼠胚胎siRNA文庫(kù)；針對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行單獨(dú)構(gòu)建，最后形成RNAi文庫(kù)[3]；Nichols等[7]以重組酶為基礎(chǔ)構(gòu)建了能產(chǎn)生隨機(jī)siRNA的RNAi文庫(kù)；Wang等[8]構(gòu)建了滾環(huán)復(fù)制介導(dǎo)的發(fā)卡RNA系統(tǒng)，創(chuàng)建了擬南芥RNAi突變體庫(kù)[9]和水稻RNAi突變體庫(kù)[10]。

發(fā)夾RNA（hpRNA）在RNAi文庫(kù)構(gòu)建中起到了至關(guān)重要的作用，研究表明，在一定范圍內(nèi)，短loop有利于hpRNA的形成和穩(wěn)定，但loop過(guò)短會(huì)影響反向重復(fù)結(jié)構(gòu)DNA分子在細(xì)菌內(nèi)的克隆。當(dāng)莖環(huán)比例超過(guò)6∶1時(shí)，反向重復(fù)序列便不穩(wěn)定，造成缺失或重排[11]。

hpRNA的特殊結(jié)構(gòu)不僅會(huì)在分子內(nèi)形成莖環(huán)狀，而且還會(huì)在分子間形成二聚體。對(duì)于合適序列比例的hpRNA，如何通過(guò)合適的條件處理DNA合成公司提供的DNA干粉從而使其形成理想狀態(tài)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定hpRNA的制備條件顯得尤為重要。目前，涉及的制備方法迄今鮮見(jiàn)報(bào)道。

植物體內(nèi)ROS（Reactive oxygen species，活性氧）的積累由2個(gè)系統(tǒng)控制：ROS產(chǎn)生和ROS清除系統(tǒng)。在ROS清除系統(tǒng)中，有酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)，酶類抗氧化物質(zhì)包括MDAR、CAT、APX、GR和GPX。GSHASC循環(huán)在清除ROS中起到了重要的作用，其中，MDAR是植物體內(nèi)清除ROS的主要酶類，以MDHA為反應(yīng)底物，將其還原為ASC。為了驗(yàn)證制備新方法所獲得的穩(wěn)定hpRNA是否可以用于RNAi載體的構(gòu)建并達(dá)到基因表達(dá)干擾的效果，筆者利用制備新方法制備hpRNA，采用REGS方法構(gòu)建ZmMDAR RNAi載體，通過(guò)Grx1roGFP2（氧化還原敏感的綠色熒光蛋白探針）和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)干擾的效果，以期為RNAi載體所介導(dǎo)的干擾作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1hpRNA制備方法①配制20%非變性聚丙烯酰胺凝膠（30%聚丙烯酰胺（29∶1）27 mL，5×TBE 8 mL，定容至40 mL，加10%過(guò)硫酸銨 250 μL，TEMED 25 μL，室溫凝固時(shí)間大于1 h），配制退火溶液（10 mmol/L Tris，pH 7.5，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）；②將DNA合成公司提供的DNA干粉，溶于超純水定量為500 ng/μL；③制備方法1：2 μL DNA與8 μL H2O混勻煮沸5 min后冰上冷卻上樣；制備方法2：2 μL DNA與8 μL H2O混勻直接上樣；制備方法3：2 μL DNA與8 μL H2O混勻，95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，后上樣。取不同方法制備的10 μL hpRNA，上樣。

1.2玉米材料和生長(zhǎng)條件 選取飽滿的玉米B73種子，用3%H2O2浸泡約24 h，清水沖洗后將其播種在濕潤(rùn)的蛭石中；生長(zhǎng)條件：光周期16 h/d，溫度22 ℃；21 d后，將幼苗從蛭石中取出，盡量避免傷及根部，用清水將根部附著的蛭石沖洗干凈，水中靜置1 h以消除創(chuàng)傷刺激。之后取葉片。

1.3ZmMDAR的RNA干擾載體構(gòu)建 按照制備新方法3制備50 nt hpRNA獲得ZmAPX的反向重復(fù)片段，采用REGS方法構(gòu)建ZmMDAR RNAi載體得到9zfPubiZmMDAR RNAiTnos。

1.4原生質(zhì)體的共轉(zhuǎn)化分離玉米葉肉原生質(zhì)體，采用Pure YieldTM Plasmid Midiprep System提取質(zhì)粒9zf（）Pubi Grx1roGFP2Tnos和9zfPubiZmMDAR RNAiTnos，濃度約1 μg/μL。將2份質(zhì)粒等量混合，加入200 μL原生質(zhì)體，彈勻后加入220 μL 40%PEGCa2+，室溫培養(yǎng)15 min，用800 μL W5洗滌2次，后加入1 mL W5重懸，輕輕混勻，平放于培養(yǎng)皿中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.5Realtime PCR提取玉米葉片或原生質(zhì)體RNA，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，當(dāng)原生質(zhì)體RNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)，引物更換為oligo d（T）以避免隨機(jī)擴(kuò)增造成的基因表達(dá)量。在Realtime PCR中，20.0 μL反應(yīng)體系：8.8 μL cDNA（稀釋20倍），10.0 μL 2× SYBR premix Extaq，0.8 μL primers，0.4 μL ROX。ABI 7500儀器運(yùn)行程序：95 ℃2 min；95 ℃15 s 和60 ℃34 s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)入溶解曲線階段。以GAPDH為內(nèi)參基因，未處理的葉片或原生質(zhì)體為對(duì)照樣品，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6激光共聚焦顯微鏡觀察以9zf（）PubiGrx1roGFP2Tnos和9zfPubiMCSTnos混合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體為對(duì)照，取適量9zf（）PubiGrx1roGFP2Tnos和9zfPubiZmMDAR RNAiTnos原生質(zhì)體于載玻片上，在405和488 nm 2個(gè)通道中進(jìn)行觀察，每個(gè)樣品中選取10個(gè)不同的原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行層掃拍攝。

2結(jié)果與分析

2.1hpRNA制備新方法在hpRNA制備方法中，選擇50 nt寡核苷酸（序列：GGGTTCGATCGTCACTGGCCGTCGTTTTACCAGTGACGAGTTAACCCTGC）和39 nt寡核苷酸（序列：TTGGATCCCGGTTCAAAGAGTAGTACCGGGATCCAAAGG）。通過(guò)RNA structure 5.7軟件預(yù)測(cè)了50和39 nt寡核苷酸的hpRNA，這表明在合適的制備條件下，寡核苷酸只能在分子內(nèi)形成預(yù)期的結(jié)構(gòu)即hpRNA，約22和18 bp（圖1），而不能在分子間形成二聚體，約50和39 bp。為了研究hpRNA的制備條件，首先配制了20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，1 μg DNA上樣。由圖2可知，50和39 nt寡核苷酸在經(jīng)方法1和方法3處理后，只有22和18 bp的產(chǎn)物，所獲得的hpRNA占有幾乎100%的比例，表明寡核苷酸經(jīng)方法1（煮沸5 min后冰上冷卻）和方法3（95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min）處理，只能在分子內(nèi)形成hpRNA，而不能在分子間形成二聚體。因此，在構(gòu)建RNAi載體時(shí)，可以選擇方法1和方法3制備出更多比例的hpRNA。

Fig.1hpRNA predicted by RNA structure2.2ZmMDAR家族的基因?yàn)榱颂骄縕mMDAR家族和AtMDAR家族的進(jìn)化關(guān)系，將AtMDAR序列號(hào)輸入到PLAZA2.5軟件中，確定了ZmMDAR家族的2個(gè)基因（表1）。

2.3hpRNA在ZmMDAR的RNA干擾載體中的應(yīng)用按照制備新方法3制備50 nt hpRNA，通過(guò)REGS方法獲得了MDAR1 RNAi和MDAR2 RNAi構(gòu)建的反向重復(fù)片段（圖3）。最后，與CIP處理的9zfMCS載體連接，得到了最終的干擾載體，用于瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)源基因表達(dá)變化引起的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)改變的分析。

ZmMDAR基因的功能意味著該基因的表達(dá)下降必然引起玉米體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，hpRNA介導(dǎo)的干擾載體是否會(huì)引起這種狀態(tài)改變有待于進(jìn)一步檢測(cè)。通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化玉米葉肉原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)玉米原生質(zhì)體中的ZmMDAR表達(dá)量下降（圖41），同時(shí)也觀察到ZmMDAR的表達(dá)量下降引起了原生質(zhì)體內(nèi)的氧化，相對(duì)于對(duì)照的熒光比值1.22，Grx1roGFP2探針的熒光比值均不同程度的上升（圖42a），MDAR1和MDAR1干擾載體轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體中的熒光比值大幅度上升，約為2.62和2.60（圖42b和42c））。Grx1roGFP2探針的熒光比值變化表明hpRNA介導(dǎo)的干擾載體引起了原生質(zhì)體氧化還原狀態(tài)的變化，同時(shí)，也表明通過(guò)制備方法3所制備的穩(wěn)定50 nt hpRNA，為基因表達(dá)的干擾作用奠定了基礎(chǔ)。

1.全式金100 bp ladder；2.玉米APX cDNAs片段被Sfi I酶切后電泳圖；3.制備方法3獲得的50 nt hpRNA；4.MDAR cDNAs片段與50 nt hpRNA連接后，經(jīng)phi29聚合酶滾環(huán)擴(kuò)增；5.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Asc I酶切，獲得單個(gè)反向重復(fù)片段；6.全式金1 kb ladder。

3結(jié)論與討論

hpRNA在RNAi文庫(kù)構(gòu)建中起到了至關(guān)重要的作用，該研究利用制備方法3制備50 nt hpRNA，后采用REGS方法構(gòu)建了ZmMDAR RNAi載體，通過(guò)Grx1roGFP

2探針和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)干擾的效果。結(jié)果表明，通過(guò)制備方法3所制備的穩(wěn)定50 nt hpRNA，為基因表達(dá)的干擾作用奠定了基礎(chǔ)。

在hpRNA制備方法中，該研究采用95 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min可以獲得更多比例的預(yù)期hpRNA，然而，這些是針對(duì)較短序列而言的，對(duì)于較長(zhǎng)序列，是否具有同樣的優(yōu)化條件，需要進(jìn)一步研究。

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