文/王小亮 徐立蒲 王靜波 王姝 曹歡 張文 王澎

虹鱒魚源氣單胞菌的藥物感受性及變化

文/王小亮 徐立蒲 王靜波 王姝 曹歡 張文 王澎

本文從北京市兩家虹鱒魚養(yǎng)殖場的發(fā)病魚體上共分離出25株疑致病性氣單胞菌，其對磺胺類藥物呈現(xiàn)較高的耐受性，耐藥率均在84%以上。虹鱒魚源氣單胞菌對鹽酸多西環(huán)素和氟喹諾酮類藥物較為敏感，耐藥率均低于10%；其中鹽酸多西環(huán)素為最敏感的藥物，敏感率為100%。氟苯尼考易使病原菌短時間產(chǎn)生較高的耐藥性。研究表明不同種類的菌株對抗菌藥物的感受性不同，同種菌的不同菌株之間對抗菌藥物的感受性也不同，需要針對具體樣品及時檢測，依據(jù)檢測結(jié)果指導養(yǎng)殖者合理使用抗菌藥物，才可能取得較好的效果。

當前，細菌性疾病是危害魚類養(yǎng)殖的最主要的生物源性疾病。防治細菌性疾病的主要手段是使用化學藥物，但在使用過程中藥物濫用問題突出，主要表現(xiàn)在輕預防重治療和濫用藥物。針對藥物濫用突出問題，已經(jīng)引起各相關(guān)部門、學者的高度關(guān)注。并開展了相關(guān)的基礎(chǔ)理論和應用技術(shù)研究。北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站自2009年開始在魚類病原菌的耐藥性方面開展研究和應用，篩選了適合北京市養(yǎng)殖魚類主要病原菌的分離、鑒定、保種方法以及病原菌藥物感受性檢測方法。

本文旨在通過開展虹鱒魚氣單胞菌的藥物感受性普查，獲得虹鱒魚源氣單胞菌對漁用抗菌藥物感受性及其變化的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，了解和掌握抗菌藥物的使用對氣單胞菌耐藥性的變化規(guī)律，指導虹鱒魚養(yǎng)殖者科學合理使用漁用抗菌藥物。

一、材料和方法

1.材料

（1）菌株

2015年4月至2015年10月，從北京懷柔區(qū)順通虹鱒魚養(yǎng)殖中心和臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司飼養(yǎng)的虹鱒魚體內(nèi)分離到25株氣單胞菌，其中嗜水氣單胞菌8株、溫和氣單胞菌9株，殺鮭氣單胞菌8株。菌株詳細信息見表1。

表1.虹鱒魚源氣單胞菌來源

（2）儀器和試劑

超低溫冰箱（MDF-382，日本SANYO公司）、生化培養(yǎng)箱（LRH-150B，上海一恒公司）、細菌濁度計（WGZ-2-X，上海昕瑞儀器儀表有限公司）、PCR儀（Mastercycle Gradient，德國Eppendorf公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（IS-3400， Alpha Innotech 公司）。

Mulluer-Hinton肉湯（MHB）和RS瓊脂購于北京陸橋技術(shù)有限責任公司，腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）和腦心浸液瓊脂（BHIA）購于英國OXOID公司。鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、甲砜霉素、鹽酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星、磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲氧嘧啶鈉、新諾明等9種抗菌藥物為原料藥。

2.方法

（1）采樣方法

采樣方法為固定每月中旬采樣1次，在虹鱒魚發(fā)病時，及時采集樣品；未發(fā)病時，取池塘中游動緩慢的魚（不少于6尾）和原池水裝入高壓聚乙烯袋，加冰塊，立即運回實驗室。采集樣品時，記錄漁場的發(fā)病情況、發(fā)病水溫、用藥情況、魚類死亡情況等信息。

（2）病原菌分離、鑒定方法

取4尾病虹鱒魚，分別無菌操作取肝、腎組織塊，首先接種于腦心浸液肉湯（BHI），然后在腦心浸液瓊脂（BHIA）劃線分離。前者22℃增菌24小時～48小時，然后采用RS瓊脂劃線分離，選擇黃色、圓形、微凸且有芳香性氣味的菌落進行純化。后者于22℃培養(yǎng)72小時，若出現(xiàn)產(chǎn)褐色素的菌落，則分離純化。

純化的菌落采用API鑒定系統(tǒng)進行鑒定，如為氣單胞菌，則采用BHI在適宜溫度增菌16小時～20小時，-80℃保存。若產(chǎn)褐色素的菌落，PCR 擴增16S rDNA基因，測序判定為殺鮭氣單胞菌，則增菌后-80℃保存。

（3）菌株的藥物感受性檢測方法

藥敏檢測借鑒美國臨床實驗室標準委員會制定的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準（2010年）》，采用其中的濃度梯度稀釋法（定量法），培養(yǎng)溫度調(diào)整為28℃，敏感線依同類藥物界定，自定標準內(nèi)沒有的抗菌藥物的敏感線。不同種類抗菌藥物的溶劑及界定的敏感線見表2。

表2.水產(chǎn)用抗菌藥物的溶劑及界定的敏感線

（4）結(jié)果記錄和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié)果記錄為將加菌的藥物濃度梯度管與對應的未加菌的藥物濃度梯度管比較，肉眼觀察試管中培養(yǎng)基變渾濁，即為未抑制菌生長，反之，為抑制菌生長。將抑制菌生長的試管中藥物濃度最低的值最為最小抑菌濃度（MIC），記錄該藥物抑制檢測菌的MIC值。

耐藥率=（高于耐藥MIC值的菌株數(shù)÷總檢測菌株數(shù)）×100%，加權(quán)平均MIC=∑（菌株數(shù)×對應的MIC值）/菌株總數(shù)。

二、結(jié)果

1.疾病種類及用藥情況

在監(jiān)測期間，虹鱒魚發(fā)生的主要病害臨床癥狀主要表現(xiàn)為：眼突出、眼潰爛、水霉、疥瘡等，其中由殺鮭氣單胞菌引起的疾病和不明病因病造成的經(jīng)濟損失最為嚴重，殺鮭氣單胞菌病造成的經(jīng)濟損失約500kg。其中，順通養(yǎng)殖場的虹鱒在4月份發(fā)生突眼病，采用過氟苯尼考和嗯諾沙星，使用時間3天，使用劑量均為10mg/kg魚。在6月13日發(fā)生殺鮭氣單胞菌病（后確診），連續(xù)使用7天氟苯尼考，劑量約為20mg/kg魚；使用3天嗯諾沙星，劑量約為15mg/kg魚；后采用鹽酸土霉素和三黃粉。9月初，發(fā)生不明病因病，使用氟苯尼考，劑量約為15mg/kg魚。兩個養(yǎng)殖場采用的藥物種類和總用量如下：聚維酮碘8箱（500mL/瓶，20瓶/箱），鹽酸土霉素10kg，氟苯尼考2.5kg，鹽酸恩諾沙星5kg，三黃粉8.8kg。并且調(diào)查發(fā)現(xiàn)兩個虹鱒魚養(yǎng)殖場曾連續(xù)多年使用氟苯尼考。

2.虹鱒魚源氣單胞菌對抗菌藥物的感受性總體情況

總體上，北京市虹鱒魚源氣單胞菌對磺胺類藥物耐藥最為嚴重，耐藥率均在84%以上，耐藥濃度在512g/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐藥率約為60%，耐藥濃度在30g/mL以上。耐藥率低于10%的藥物種類為乳酸諾氟沙星、煙酸諾氟沙星和鹽酸多西環(huán)素，耐藥率分別為8.0%、4.0%和0%。詳見表3。

表3.虹鱒魚源氣單胞菌對抗菌藥物的感受性分布表

3.不同種類病原菌對抗菌藥物的感受性

從表4可以看出，不同種類的菌株對抗菌藥物的感受性不一樣，如嗜水氣單胞菌對乳酸諾氟沙星的耐藥率達25.0%，而溫和氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的耐藥率為0%。溫和氣單胞菌對硫酸新霉素的耐藥率為55.6%，嗜水氣單胞菌的耐藥率為25.0%，殺鮭氣單胞菌為0%，加權(quán)平均MIC值也有較大差異。另外，同種菌的不同菌株之間對抗菌藥物的感受性也不一樣，例如溫和氣單胞菌對乳酸諾氟沙星的感受性，有些MIC為8g/mL，有些為0.5g/mL，有些則≤0.25g/mL。

表4.不同病原菌種類的加權(quán)平均MIC值和耐藥率

4.病原菌隨使用抗菌藥物的感受性變化

將順通養(yǎng)殖場不同日期分離的虹鱒魚病原菌的MIC值進行加權(quán)平均，形成病原菌加權(quán)平均MIC值隨時間的變化圖（見圖1）。顯然，病原菌的加權(quán)MIC值隨藥物的使用呈現(xiàn)上升趨勢，而隨藥物的停用逐漸下降。說明藥物使用與病原菌的加權(quán)平均MIC值呈正相關(guān)性。其中氟苯尼考在使用過程中，更易使病原菌短時間產(chǎn)生較高的MIC值。

圖1.順通養(yǎng)殖場虹鱒魚病原菌加權(quán)平均MIC值隨時間的變化圖

三、討論

本文從北京市兩家虹鱒魚養(yǎng)殖場的發(fā)病魚體上共分離出25株疑致病性氣單胞菌，其對磺胺類藥物呈現(xiàn)較高的耐受性，耐藥率均在84%以上。研究表明：病原菌體外耐藥體內(nèi)一定耐藥。因此，這兩家養(yǎng)殖場現(xiàn)階段暫不能使用該類藥物用于虹鱒魚的疾病防治。

氟苯尼考是我國1999年批準的一種新型的動物專用的氯霉素類廣譜抗生素，曾廣泛應用于養(yǎng)殖生產(chǎn)。近年的室內(nèi)研究報道，氟苯尼考容易使病原菌短時間產(chǎn)生較高的耐藥性，并且耐藥性消失較慢。本文從養(yǎng)殖場獲取的數(shù)據(jù)驗證了這一結(jié)論。同時，抗菌藥物的使用與氣單胞菌的MIC值呈正相關(guān)，即使按標準劑量使用抗菌藥物也會使氣單胞菌的耐藥濃度數(shù)倍增加。并且，使用嗯諾沙星會使氣單胞菌對同類藥物的耐藥性增加。

本文檢測的虹鱒魚源氣單胞菌對鹽酸多西環(huán)素和氟喹諾酮類藥物較為敏感，耐藥率均低于10%。其中鹽酸多西環(huán)素為最敏感的藥物，敏感率為100%。由于不同養(yǎng)殖場、不同病原菌種類、甚至同種病原菌的不同菌株對抗菌藥物的感受性不同，因此在實際生產(chǎn)中針對某一漁場樣品，需要針對具體樣品及時檢測，依據(jù)檢測結(jié)果指導養(yǎng)殖者合理使用抗菌藥物，才可能取得較好的效果。本文的結(jié)果，可以用于養(yǎng)殖場無法送樣時，可參考使用文中的敏感藥物及劑量。

本文采用的兩種氟喹諾酮類藥物乳酸諾氟沙星和煙酸諾氟沙星已經(jīng)于2016年1月1日起禁止用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，屆時可采用該類藥物中的嗯諾沙星。

采用藥物控制細菌性疾病，只是魚病診治過程中的一個重要環(huán)節(jié)，在考慮到使用敏感藥物種類及劑量情況下，還應同時關(guān)注養(yǎng)殖水環(huán)境以及魚體免疫水平的改善。

作者單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站