崔成姬 鄒 迪 張洪寶 張守琳

枸芪復腎丸質(zhì)量標準研究※

崔成姬 鄒 迪 張洪寶 張守琳

目的 建立枸芪復腎丸質(zhì)量標準。方法 將枸芪復腎丸中枸杞子、黃芪、當歸采用薄層色譜法進行定性檢測，對處方中君藥黃芪中有效成份黃芪甲苷以及臣藥當歸中有效成份阿魏酸采用高效液相色譜法進行定量檢測。結(jié)果 在薄層色譜中能檢出枸杞子、黃芪和當歸；含量測定中黃芪甲苷在1.978～9.890 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9995）；阿魏酸含量在0.05～0.5 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r=0.9993）。結(jié)論 建立的分析方法簡便可行，專屬性強，可用于枸芪復腎丸的質(zhì)量控制。

枸芪復腎丸；薄層色譜法；高效液相色譜法

枸芪復腎丸是由枸杞子、當歸、黃芪等17味中藥組成，是根據(jù)長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院名老中醫(yī)多年臨床經(jīng)驗研制而成，具有滋陰補腎、健脾利濕，活血化瘀的作用，自1996年枸芪復腎丸作為院內(nèi)制劑主要用于治療慢性腎炎伴血尿、少量蛋白尿，在臨床已應用19年，其可明顯改善患者癥狀、體征［1］?？茖W的質(zhì)量標準有利于制劑的質(zhì)量穩(wěn)定、確保使用安全［2］。本研究就枸芪復腎丸的質(zhì)量標準制訂了簡便可行、準確可靠的定性、定量檢測方法，為建立枸芪復腎丸的質(zhì)量評價體系提供初步依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀；N2000色譜工作站；BSA124S 型電子天平。

1.2試劑與藥品 黃芪甲苷，批號：110781-200613；阿魏酸對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110773-201208；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；枸芪復腎丸，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長衛(wèi)藥制字（96）1413號。

1.3枸芪復腎丸組成 槐花372 g、當歸148.8 g、白茅根372 g、赤芍111.6 g、茯苓372 g、枸杞子148.8 g、女貞子223.2 g、紅花111.6 g、墨旱蓮223.2 g、益母草223.2 g、牡丹皮148.8 g、地黃223.2 g、大薊223.2 g、小薊223.2 g、梔子111.6 g、大黃74.4 g、黃芪148.8 g。

2 方法與結(jié)果

2.1黃芪的薄層色譜鑒別 取枸芪復腎丸8 g放入三角瓶內(nèi)，加甲醇處理，濾過，蒸干，殘渣加水使其溶解，以水飽和正丁醇反復提取3次，將3次正丁醇液混合，放入濃氨試液反復洗滌5次，將氨試液丟棄，把正丁醇液水浴蒸干，最后用甲醇使殘渣溶解，當作供試品溶液。另取對照品黃芪甲苷，將對照品加入甲醇中制成每升含1 mg的對照品溶液；按照薄層色譜法試驗，吸取各10 μl上述兩種溶液，先后點于相同硅膠G薄層板上，展開劑為氯仿-甲醇-水（比例為13：7：2）的10 ℃放置的下層溶液，先后給予展開、取出、晾干，噴上10%硫酸乙醇溶液，用熱風吹至斑點清晰顯色，最后至365 nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與相應的對照品色譜的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1　黃芪薄層層析圖（1為黃芪甲苷對照品，2、3、4為三批供試品）

2.2枸杞子的薄層色譜鑒別 取枸芪復腎丸6 g放入三角瓶內(nèi)，添加常溫水，加溫煮沸15 min，再放冷、濾過，乙酸乙酯振搖提取濾液，同時用乙酸乙酯液濃縮至1 ml，此為供試品溶液。同法制成枸杞子對照藥材；按照薄層色譜法（附錄VIB）試驗，上述兩種溶液各吸取5 μl，分別點于相同硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3：2：1），依次展開、取出、晾干，至365 nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2　枸杞子薄層層析圖（1為枸杞子對照藥材，2、3、4為三批供試品）

2.3當歸的薄層色譜鑒別 取藥丸3 g，放入提取器中，加甲醇提取至近無色，回收甲醇，殘渣加水20 ml溶解，冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙醚提取3次，每次10 ml，合并乙醚液，乙醚液用2%碳酸鈉溶液提取3次，每次10 ml，棄去乙醚液，堿液用醋酸乙酯15 ml洗脫一次，棄去醋酸乙酯，堿液加鹽酸酸化至pH 2～3，再用苯15 ml洗脫1次，棄去苯液，繼用乙醚提取3次，每次10 ml，揮去乙醚，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取出阿魏酸鈉對照品，加入甲醇制成溶液濃度為1 mg/ml，此為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取容量為10 μl的供試品溶液和5 μl的對照品溶液，依次點于相同硅膠G薄層板上，以苯-冰醋酸-甲醇（30：1：3）為展開劑，20 ℃以下展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢測。供試品色譜中，在與對照藥材色譜定量檢測，陰性無干擾，結(jié)果見圖3。

圖3　當歸薄層層析圖（1為阿魏酸對照藥品，2、3、4為三批供試品）

3 含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC），通過制作標準曲線，用外標一點法計算本品中各有效成分的含量。

3.1黃芪甲苷

3.1.1色譜條件 色譜柱：Nova-PaK（R）C18（3.9 mm ×150 mm Columm）；流動相：乙腈-水（37：63）；流速：0.8 ml/min；進樣量：20 μl。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于2000。在此條件下，樣品分離良好。

3.1.2對照品溶液配制 2 ml量瓶中放入黃芪甲苷對照品1.977 mg，用甲醇溶解后定容，配成濃度為0.989 mg/ml的溶液。

3.1.3供試品溶液制備 抽取本品5 ml，使用水飽和的正丁醇5 ml分別萃取6次，再采用40%氨水25 ml洗滌，合并正丁醇液。丟棄堿水層，一直回收正丁醇層直至干燥，放入甲醇溶解并定容至10 ml，過微孔濾膜，取20 μl進樣。

3.1.4陰性對照品制備 制作不含黃芪的陰性樣品（參照枸芪復腎丸制備工藝），陰性對照溶液按供試品溶液制備方法制作。

3.1.5線性關(guān)系考察 分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml的對照品溶液，放入容積為1 ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣量20 μl，用外標一點法計算本品黃芪甲苷含量。峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。得回歸方程為y=7.1421x－1.4661，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。表明在1.978～9.890 μg范圍內(nèi)黃芪甲苷線性關(guān)系良好。

3.1.6精密度試驗 取標準曲線中的對照品溶液20 μl（質(zhì)量濃度為0.297 mg/ml），重復進樣6次，測得黃芪甲苷相對標準偏差（RSD）為0.98%。

3.1.7穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗樣品，在0、12、48 h后進行測定，黃芪甲苷RSD=1.23%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

3.1.8重復性試驗 取同一批枸芪復腎丸（批號：20140812），按樣品的制備方法制備供試品溶液，并進行測定，測得黃芪甲苷RSD=0.16%，表明該方法重復性較好。

3.1.9回收率實驗 精密稱取樣品共6份，各約1.0 g，分別加入對照品黃芪甲苷溶液5.0 ml，按樣品色譜條件測定計算平均回收率為99.15%，RSD為1.22%，表明本法加樣回收率良好。

表1　黃芪甲苷回收率試驗

3.2阿魏酸［3］

3.2.1色譜條件 Nova-PaK（R）C18（3.9 mm×150 mm Columm）；流動相：甲醇色譜純?nèi)芤海?%冰醋酸溶液（37：63）；檢測波長：323 nm；流速：0.5 ml/min；靈敏度：0.05AUFS。

3.2.2阿魏酸標準溶液的配制 精密稱取阿魏酸標準制備1 mg，用流動相溶液配制為1 mg/ml的溶液。再進一步稀釋為5、8、10、20、30、40 μg/ml的標準品溶液。

3.2.3阿魏酸樣品溶液配制 取之前薄層色譜方法中提取的1 ml阿魏酸供試品溶液，將甲醇溶液揮干后，樣品溶液用流動相溶液1 ml溶解制成。

3.2.4陰性對照品配制 制作不含當歸的陰性樣品（按枸芪復腎丸制備工藝），陰性對照溶液按供試品溶液的制備方法制成。

3.2.5線性關(guān)系考察 分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml的對照品溶液，放入容積為1 ml的量瓶中，稀釋液用甲醇，搖勻，進樣量為20 μl，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。用外標一點法計算本品阿魏酸含量。通過以峰面積為縱坐標，以阿魏酸標準品的含量為橫坐標制作標準曲線。得到回歸方程：y=2.4107x－1.6091，R2=0.9993。在0.05～0.5 μg范圍內(nèi)阿魏酸含量呈良好的線性關(guān)系。

3.2.6精密度試驗 取標準曲線中的質(zhì)量濃度為0.286 mg/ml的對照品溶液20 μl，反復進樣6次，測得阿魏酸RSD=0.96%。

3.2.7穩(wěn)定性試驗 取精密度試驗的樣品，在0、12、48 h后進行測定，阿魏酸RSD=1.34%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

3.2.8重復性試驗 取同一批枸芪復腎丸（批號：20140812），按樣品的制備方法制備供試品溶液，并進行測定，測得阿魏酸RSD=0.16%，表明該方法重復性較好。

3.2.9回收率實驗 精密稱取樣品共6份，各約1.0 g，分別加入對照品阿魏酸溶液5.0 ml，按樣品色譜條件測定計算平均回收率為99.24%，RSD為1.30%，表明本法加樣回收率良好。

表2　阿魏酸回收率試驗

4 討論

本實驗利用薄層層析方法分別對該制劑中枸杞子、黃芪、當歸進行定性鑒別，并建立了制劑中黃芪的主要有效成分黃芪甲苷的高效液相色譜定量分析方法，同時建立了制劑中當歸主要成分阿魏酸的高效液相色譜定量分析方法。黃芪甲苷可以減輕過氧化氫誘導的腎小球系膜細胞的氧化應激損傷［4］，阿魏酸（4-羥-3-甲氧基肉桂酸）具有抗血小板聚集、緩解血管痙攣等作用，故本藥具有治療血尿和蛋白尿的作用。本實驗建立的方法操作簡單，專屬性強，重復性好，結(jié)果準確，可用于枸芪復腎丸的質(zhì)量控制與分析。

［1］張守琳，王銀萍，王宏安.枸芪復腎丸治療慢性腎炎的臨床研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2015，16（12）：1082-1083.

［2］伍振峰，鄭琴，楊明.中藥制劑質(zhì)量控制的方法模式分析與研究［J］.中國中藥志，2012，37（9）：1332-1336.

［3］游蓉麗，李明花，喬玉峰，等.HPLC測定注射用阿魏酸鈉含量［J］.中國中藥雜志，2014，11（10）：19-21.

［4］曹玲玲，李維祖，司秀蓮，等.黃芪甲苷對腎小球系膜細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制［J］.中國中藥雜志，2013，38（5）：725-730.

R927.11

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.09.005

長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林長春 130021

吉林省中醫(yī)中藥管理局基金資助項目（2014-ZC47）；吉林省科技廳基金資助項目（20130206071YY）；吉林省教育廳基金資助項目（2014第65號）