謝文申 付晏昆 周露 張青華

摘要 [目的]采用熱處理結(jié)合莖尖分生組織培養(yǎng)的方法，研究薄荷組培脫毒技術(shù)。[方法] 以薄荷組培苗為試材，在高溫?zé)崽幚聿煌鞌?shù)后剝?nèi)∏o尖，進行薄荷花葉病毒脫毒技術(shù)研究，同時采用RT-PCR法檢測其脫毒效果。[結(jié)果]適合薄荷熱處理時間為20～45 d，試管苗的成活率可達66.7%～90.0%；32～38 ℃熱處理35～45 d剝?nèi)?.3～0.5 mm的莖尖進行培養(yǎng)，脫毒率為100.0%。[結(jié)論] 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)是一種脫除薄荷病毒的有效途徑。

關(guān)鍵詞 薄荷；組織培養(yǎng)；熱處理；脫毒；RT-PCR

中圖分類號 S567.23+5 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）06-0061-02

Study on Virus-free Technique of Mentha haplocalyx by Tissue Culture

XIE Wen-shen 1 FU Yan-kun 2 ZHOU Lu 1 ZHANG Qing-hua 3

（1 Spice Research Institute of Yunnan Agricultural University，Kunming Yunnan 650051； 2 Kunming University； 3 College of Horticulture and Landscape of Yunnan Agricultural University）

Abstract [Objective] The technique of virus-free in Mentha haplocalyx was studied by combing tissue of shoot-tip with heating treatment.[Method] Mentha haplocalyx in vitro was used as test material in this experiment to eliminate by combing tissue of shoot-tip with heat therapy，and detected by indirect RT-PCR method.[Result] The suitable time for heat treatment was 20～45 days，the survival rate of tissue culture seedling was up to 66.7%～90.0%；0.3～0.5 mm shoot-tip with heat treatment by 32～38 ℃ for 35～45 days of Mentha haplocalyx were 100.0% free from CMV and TMV.[Conclusion] Combing tissue of shoot-tip with heating treatment is an efficient way of virus-free in Mentha haplocalyx.

Key words Mentha haplocalyx；tissue culture；heat treatment；virus-free；RT-PCR

薄荷（Mentha haplocalyx Briq），唇形科薄荷屬多年草本。性涼味辛，以全草入藥；具有清利頭目、透疹功能，用于治療風(fēng)溫初起[1-5]、風(fēng)熱感冒、頭痛、麻疹、喉痹、風(fēng)疹、目赤等癥。薄荷是世界三大香料之一[4]，在國際市場上，薄荷主要作為食品、化妝品的添加劑，用來增加氣味、改善口味等。現(xiàn)階段，薄荷的市場需求量巨大。但薄荷在生長過程中，由于品種更新緩慢、易感毒、優(yōu)良性狀退化等原因，導(dǎo)致薄荷的產(chǎn)量和經(jīng)濟效益都大大降低[1，5-6]。薄荷的主要病毒是黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病（TMV）[7]。

熱處理主要是利用病毒和寄主植物對高溫忍耐性的差異，當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的適當(dāng)高溫環(huán)境時[1-5]，可部分或完全鈍化植物組織中的病毒，但寄主植物組織很少或不會受到傷害。在馬鈴薯、草莓和葡萄的脫毒研究[8-13]中，熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法的應(yīng)用最多；而在觀賞植物上，熱處理在百合、大麗花和羅漢果的脫毒研究[14-19]中也有應(yīng)用，脫毒效果均很好。尚未見該法應(yīng)用于薄荷脫毒的研究報道。本文以感病野生薄荷為材料，采用“熱處理+莖尖培養(yǎng)”的脫毒方法，培養(yǎng)脫毒薄荷組培苗的培養(yǎng)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

田間選取表現(xiàn)花葉癥狀的野薄荷品種[1]，采用RT-PCR測定法，檢測煙草花葉病毒（TMV）及黃瓜花葉病毒（CMV）。試驗材料為經(jīng)檢驗呈陽性的母株，采取其頂芽及帶芽莖段為外植體[2]。

1.2 試驗方法

1.2.1 準(zhǔn)備脫毒材料。用飽和肥皂粉液刷洗外植體，要求清洗干凈，在流水下沖洗60 min后，置于超凈臺。先用75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精加數(shù)滴吐溫滅菌30 s，用無菌水涮洗3遍，每遍1 min，再添0.1%升汞滅菌8～10 min，最后用無菌水涮洗5～7遍[1-5]，每遍1 min。滅菌后將外植體轉(zhuǎn)入啟動培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。30 d后可轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，以繼代的試管苗為外植體。

1.2.2 莖尖培養(yǎng)法。取1.2.1中試管苗的頂芽，借助解剖鏡剝?nèi)∏o尖，長度分別為0.3、0.5、0.8 mm，接種于繼代培養(yǎng)基中，每個處理水平接種30個莖尖。在25 d后統(tǒng)計成活率，50 d后統(tǒng)計脫毒率。

1.2.3 熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法。取1.2.1中試管苗的頂芽，借助解剖鏡，剝?nèi)￠L度為0.8 mm的莖尖，接種于繼代培養(yǎng)基中，15 d后進行熱處理。主要采用晝夜變溫及逐步升溫的方式。熱處理設(shè)置的最終溫度為：白天38 ℃，晚上32 ℃。熱處理前期采取逐步升溫的方式對試管苗進行預(yù)處理，即設(shè)置白天起始溫度為28 ℃，逐漸升至38 ℃時停止[1-6]；夜間起始溫度為26 ℃，逐漸升至32 ℃時停止。這樣經(jīng)過預(yù)處理后再以白天38 ℃，晚上32 ℃，進行最終的熱處理，分別繼續(xù)處理30、40、58 d。在人工氣候箱中完成熱處理過程，人工氣候箱光照時間、光照強度、相對濕度分別為14 h、2 000 lx、70%。熱處理后對成活的試管苗剝?nèi)￠L度為0.4～0.5 mm的莖尖接種于啟動培養(yǎng)基中，每個時間處理下接種30個莖尖。分別在10、15、20、25 d后統(tǒng)計成活率，50 d后統(tǒng)計脫毒率。計算公式如下：

成活率（%）=■×100

脫毒率（%）=■×100

1.2.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。采用MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的BA、NAA。培養(yǎng)基煮沸后調(diào)pH值至5.8，注入培養(yǎng)瓶中，封口后于120 ℃高壓鍋中滅菌30 min。啟動培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS無激素培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均添加0.7%瓊脂、3%蔗糖。試驗培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度為（23±2）℃，連續(xù)光照時間12 h/d，光照強度1 500～2 000 lx。15～20 d繼代1次。

1.2.5 病毒檢測方法。待莖尖分化成苗后，取株高6～7 cm的薄荷試管苗，利用RT-PCR技術(shù)對CMV和TMV病毒進行檢測，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院進行病毒檢測并出具檢測報告。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖培養(yǎng)中不同莖尖長度對薄荷成活率和脫毒率的影響

由表1可知，切取0.3～1.0 mm的薄荷莖尖分生組織均可誘導(dǎo)出綠苗，但莖尖大小對成活率影響較大，當(dāng)莖尖<0.5 mm時，需培養(yǎng)15 d才出綠苗，約35 d才能形成正常植株，脫毒率可達80.0%，但成活率僅約50.0%[1-4]。當(dāng)莖尖分生組織在1.0 mm時，10 d即可誘導(dǎo)出綠苗，約25 d形成小植株，成活率達90.0%，脫毒率只有63.0%。以后的繼代周期只需要15～20 d。

2.2 不同熱處理時間對薄荷莖尖成活率的影響

薄荷組培苗培養(yǎng)15 d后，放置于32～38 ℃光照培養(yǎng)箱中進行晝夜變溫?zé)崽幚?。由?可知，試管苗的成活率伴隨著熱處理時間的延長而逐漸降低。熱處理15～25 d后，組培苗生長遲緩、葉片變黃，甚至枯亡。熱處理30 d時，組培苗組織受損程度伴隨熱處理時間的延長而加劇，部分組培苗因不耐持續(xù)高溫處理而死亡。當(dāng)熱處理至50 d時，成活率僅為23.3%。43 ℃處理的材料則全部死亡。因此，應(yīng)選熱處理35～45 d的試管苗。

2.3 熱處理后莖尖培養(yǎng)對薄荷莖尖成活率的影響

選取熱處理后成活的試管苗，剝?nèi)￠L度為0.3～1.5 mm不等的莖尖進行繼代培養(yǎng)，60 d后統(tǒng)計成活率[1-4]。莖尖的大小與莖尖成活率、莖尖轉(zhuǎn)綠時間密切相關(guān)。由表3可知，熱處理10、20、35、45 d，剝離同樣大小的莖尖，如1.0～1.5 mm，莖尖轉(zhuǎn)綠時間17、30、39、50 d，成活率分別為100.0%、96.7%、80.0%、66.7%，表明熱處理時間越長，莖尖組織受損越嚴(yán)重，莖尖轉(zhuǎn)綠時間延長[2-5]，成活率降低。而同樣熱處理20 d，分別剝?nèi)?.3～0.5、1.0～1.5 mm的莖尖，莖尖轉(zhuǎn)綠時間分別為36、30 d，莖尖成活率分別為90.0%、96.7%，說明熱處理時間相同時，莖尖越小，莖尖轉(zhuǎn)綠的時間越長，成活率也越低。

2.4 熱處理后莖尖培養(yǎng)對薄荷莖尖苗脫毒效果的影響

待莖尖苗生長至株高6～7 cm時，檢測莖尖苗的花葉病毒。結(jié)果表明，熱處理時間及莖尖大小與莖尖苗的脫毒率的關(guān)系密切。由表3可知，熱處理10、20、35、45 d后，剝?nèi)?.0～1.5 mm的莖尖，脫毒率分別為55.6%、72.8%、93.2%、96.7%，說明脫毒效果隨著熱處理時間的延長而越明顯。熱處理同樣時間，如45 d時，剝?nèi)?.3～0.5、1.0～1.5 mm的莖尖，莖尖苗脫毒率分別為100.0%、96.7%，說明熱處理時間一樣時，莖尖大小和脫毒率呈負相關(guān)，莖尖越小，脫毒率越高。熱處理10 d剝?nèi)?.0～1.5 mm的莖尖雖然成活率為100.0%，但脫毒率僅為55.6%；熱處理45 d剝?nèi)?.3～0.5 mm的莖尖，雖然成活率僅為56.7%，但脫毒率為100%。因此，要保證既要有一定的成活率，又要獲得較高的脫毒，以32～38 ℃熱處理45 d剝?nèi)?.3～0.5 mm的莖尖效果最佳，成活率可56.7%，但脫毒率為100.0%。

2.5 脫毒苗的生根與移栽

經(jīng)鑒定為脫除花葉病毒的薄荷莖尖苗，經(jīng)繼代2～3次后，選取長勢良好的2～3 cm苗接種至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)[1-5]，當(dāng)根長約2 cm時，從培養(yǎng)室中及時拿出已生根的試管苗，于室溫、自然散射光下放置2～3 d后打開瓶塞煉苗2～3 d，將根系附著的培養(yǎng)基洗凈，用多菌靈100倍液消毒后，將其栽入消過毒的蛭石和珍珠巖按1∶1比例混合而成的基質(zhì)中，澆透水，覆蓋塑料膜。在溫度為20～25 ℃，相對濕度75%～80%的條件下進行練苗，注意遮蔭和通風(fēng)。10 d后去掉覆蓋膜，2～3周后移栽苗成活，其成活率為95%。當(dāng)薄荷苗長到5葉1心時，可及時移入大田中栽植。

3 結(jié)論與討論

該文未采用單獨的熱處理方式，是因為CMV和TMV的耐熱極限溫度很高[1-3]，在此溫度下薄荷無法存活，因此選用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法來實現(xiàn)脫毒。該文采用逐步升溫后，晝夜變溫和晝夜恒溫2種方式。在溫度逐步升高的過程中，試管苗逐漸得以鍛煉，耐高溫能力得以提高，成活率得以提高[1-2]。試驗表明：晝夜變溫有利于提高試管苗成活率。由于熱處理溫度一般要求達到38 ℃，采用33～38 ℃晝夜變溫處理有利于緩解高溫對苗木的傷害，提高莖尖培養(yǎng)的成活率、提高脫毒率，且熱處理方法操作簡便，但選擇一個適宜的熱處理方式是非常重要的。

該文研究顯示，2種脫毒方法中，莖尖培養(yǎng)法中脫毒效果最好的是長度為0.3～0.5 mm的莖尖，莖尖成活率為50.0%，脫毒率為80.0%。熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法中脫毒效果最好的是：經(jīng)33～38 ℃晝夜變溫處理45 d后剝?nèi)￠L度為0.3～0.5 mm的莖尖，莖尖成活率為56.7%，脫毒率為100%。

本研究首次將熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)用于野薄荷，摸索并總結(jié)了薄荷試管苗脫毒過程中的技術(shù)參數(shù)及操作要求。通過對再生苗的脫毒率檢測，證明了熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)應(yīng)用于薄荷脫毒的可行性，將成為薄荷無病毒苗生產(chǎn)上的有效方法。

4 參考文獻

[1] 趙霜，李青，戴思蘭.不同方法脫除菊花體內(nèi)3種病毒效果的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013（8）：168-174.

[2] 吳群英，李伯林，李景云.羅漢果莖尖脫毒技術(shù)研究[J].北方園藝，2013（3）：102-104.

[3] 丁琤，徐衛(wèi)紅.薄荷脫毒苗的離體培養(yǎng)及快速繁殖[J].上饒師范學(xué)院學(xué)報，2004（6）：69-72.

[4] 王棟章，趙國芳，張祖饒，等.中國薄荷生產(chǎn)與貿(mào)易[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1992：179-218.

[5] 徐德然，高山林.薄荷組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，1992，23（2）：115-117.

[6] 薛啟漢，陳游，姜曉紅，等.薄荷離體培養(yǎng)、無性系變異與經(jīng)濟性狀改良的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，1998，14（3）：179-182.

[7] 王小剛，高山林，白雨，等.薄荷脫病毒苗的農(nóng)藝性狀和有關(guān)生理指標(biāo)的測定[J].藥物生物技術(shù)，2003，10（2）：92-95.

[8] 毛瑋，王英，金建鈞，等.馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)體系的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（33）：16257-16260.

[9] 李志強，王晶，丁國亮，等.草莓熱處理結(jié)合莖尖脫毒技術(shù)研究[J].北方園藝，2012（5）：125-127.

[10] 劉健，劉向蕾，胡繁榮，等.草莓熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒效果研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：1088-1090.

[11] 肖蕊.葡萄試管苗熱處理脫毒技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2014（5）：155.

[12] 張尊平，范旭東，胡國君，等.葡萄試管苗熱處理脫毒技術(shù)研究[J].中國果樹，2013（1）：39-41.

[13] 石貴玉，陳耕云，廖文雪.毛葡萄組織培養(yǎng)的脫毒技術(shù)[J].廣西師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，26（3）：71-74.

[14] 羅麗萍，揚柏云，蔡奇英，等.龍牙百合熱處理及莖尖培養(yǎng)技術(shù)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（1）：72-73.

[15] 王超，王文和，趙祥云，等.百合病毒脫除技術(shù)研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2012（4）：25-28.

[16] 高慧卿，樊蘭瑛，王秀紅，等.莖尖培養(yǎng)及熱處理技術(shù)在百合脫毒中的應(yīng)用研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，30（6）：528-532.

[17] 楊婷，崔志剛，陳段芬.不同處理方法對3種大麗花病毒的脫毒效果比較[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014（3）：621-625.

[18] 吳群英，李伯林，李景云.羅漢果莖尖脫毒技術(shù)研究[J].北方園藝，2013（3）：102-104.

[19] 吳群英，李伯林，李景云.羅漢果組培苗二次脫毒技術(shù)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（5）：1185-1187.