程方 葉建仁

摘要 初步探索了以濕地松幼樹新生芽為外植體的側(cè)芽增殖植株再生體系的條件，結(jié)果表明，4月中下旬為濕地松側(cè)芽增殖最佳采樣時間；20 mg/L抗壞血酸（VC）對濕地松新抽芽的褐化有一定抑制作用；6-BA的濃度為7 mg/L時，濕地松外植體的萌動最明顯；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3對經(jīng)高濃度6-BA處理后萌動的外植體的側(cè)芽增殖起促進作用；0、1、3、5 mg/L的GA3培養(yǎng)基均對新采集的外植體側(cè)芽的誘導沒有促進作用；改良GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、改良GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功誘導出側(cè)芽或不定芽，側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好。

關(guān)鍵詞 濕地松；側(cè)芽增殖；外植體；快繁技術(shù)；新抽芽

中圖分類號 S791.246 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）09-0160-02

Abstract Study on lateral buds proliferation of Pinus elliottii was done. The main results were as followed：the best acquisition time of explants was in mid-April；20 mg/L of VC could inhibite the explants to brown；the explants germinated obviously on the media with 7 mg/L 6-BA；the explants on modified GD media with 4 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L NAA and 1 mg/L GA3 induced lateral bud on high concentration 6-BA；0，1，3，5 mg/L of GA3 medium had no promating effect for the new collection of explant of lateral bud；the explants on modified GD media with 6 mg/L 6-BA and 0.4 mg/L NAA，modified GD media with 8 mg/L 6-BA and 0.3 mg/L NAA induced lateral bud successfully，and the buds grew well in the latter time.

Key words Pinus elliottii；lateral buds proliferation；explants；propagation technology；new buds

植物微體繁殖的植株再生途徑有體細胞胚胎發(fā)生植株再生、器官發(fā)生植株再生、側(cè)芽增殖植株再生[1]。在抗病育種過程中，利用種子萌發(fā)獲得帶子葉頂芽作為起始外植體的器官發(fā)生方式獲得的再生植株，其抗病性是否能保持和母本一致，還需在后期進行抗病性測定。而側(cè)芽增殖是利用頂芽和側(cè)芽中已經(jīng)形成的芽分生組織來進行增殖的，比器官發(fā)生再生植株在遺傳性上更穩(wěn)定、自發(fā)性變異頻率低、再生完整植株所需的培養(yǎng)時間短等優(yōu)點。目前以濕地松成熟胚、離體胚無菌苗、無菌實生苗等為外植體，成功地建立其器官發(fā)生的組織培養(yǎng)再生體系，并且獲得的試管苗移栽成活[2-3]，暫無濕地松側(cè)芽增殖的相關(guān)報道。因此，探索濕地松側(cè)芽增殖再生體系的條件，對加快濕地松抗病育種進程顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及無菌處理

2009年3—5月不同時間段的晴天中午分別采集南京林業(yè)大學后山苗圃五年生濕地松新抽芽為外植體，將其用洗潔精水浸泡0.5 h，流水沖洗2 h，于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s后用0.1%升汞中滅菌3.5 min，轉(zhuǎn)接至設計的初誘導培養(yǎng)基中。

1.2 初誘導培養(yǎng)基的設計

改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間采集的外植體，觀察芽的成活、污染情況，篩選出最佳采樣時間；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基，設置抗壞血酸濃度為0、10、20、40 mg/L，觀察統(tǒng)計外植體的褐化情況；以改良GD為基本培養(yǎng)基，NAA濃度0.2 mg/L，設置6-BA濃度為4、5、6、7 mg/L；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基，設置赤霉素（GA3）濃度為0、1、3、5 mg/L。以改良GD為基本培養(yǎng)基，A因素（6-BA濃度為4、6、8 mg/L）、B因素（NAA濃度為0.2、0.3、0.4 mg/L）進行完全隨機試驗，觀察統(tǒng)計誘導情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采集時間對濕地松新抽芽污染與成活的影響

外植體的分化程度及幼嫩程度對誘導結(jié)果有很大影響。因此，外植體的采集時間也成為影響試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。從春季不同采集日期，分析最佳外植體采集時間，為以后濕地松進行大規(guī)模組織培養(yǎng)工作提供依據(jù)。結(jié)果顯示，4月12日采集的外植體成活率最高，為83.3%，4月29日采集的外植體成活率次之，為81.2%，而4月22日的成活率也達到了75%的較高值?？梢?，在4月中下旬采集的外植體成活率比3月、5月的高得多，為較佳采集時間（表1）。處在迅速生長期的新抽芽及新梢莖段在不同的采集時間隨著新抽梢的伸展，其鱗片狀的芽被漸少，在相同的滅菌時間里污染率也會隨著采集時間的推遲而變化。

2.2 抗壞血酸（VC）使用濃度對濕地松新抽芽褐變的影響

抗壞血酸（VC）有防止材料褐變、抵制多酚類物質(zhì)的作用。本次結(jié)果表明，添加抗壞血酸對外植體的褐化有一定的抑制作用，添加濃度為20 mg/L時，其褐化率最低，為25%，同時成活率最高，為50%（表2）。

2.3 6-BA對濕地松新抽芽誘導的影響

6-BA的主要作用是促進芽的形成，也可以誘導愈傷組織發(fā)生。40 d后觀察到所有成活的外植體底部均膨大形成愈傷組織，6-BA濃度為7 mg/L的培養(yǎng)基中外植體的萌動最明顯（圖1D），其他濃度中的外植體只有稍微的萌動。

2.4 赤霉素（GA3）的添加對濕地松新抽芽啟動誘導的影響

孫錫本等[4]研究表明，赤霉素對蘋果側(cè)芽萌發(fā)有明顯的促進作用。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)赤霉素處理30 d后外植體均沒有增殖出側(cè)芽，表明在GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA培養(yǎng)基中，赤霉素濃度為0、1、3、5 mg/L均對濕地松側(cè)芽的誘導沒有促進作用（圖2）。

2.5 赤霉素（GA3）對經(jīng)6-BA處理過的濕地松新抽芽啟動誘導的影響

試驗結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度6-BA處理過的外植體轉(zhuǎn)接到GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+GA3（0、1 mg/L）的培養(yǎng)基中，30 d后觀察到萌動的外植體轉(zhuǎn)入不含赤霉素的培養(yǎng)基中只長出頂芽和針葉，沒有側(cè)芽（圖3B），沒有萌動的外植體轉(zhuǎn)入不含赤霉素的培養(yǎng)基后略微露出頂芽（圖3A）；萌動的外植體在含赤霉素的培養(yǎng)基中成功誘導出側(cè)芽（圖3D），而沒有萌動的外植體即使轉(zhuǎn)入含赤霉素的培養(yǎng)基中，也不能誘導出側(cè)芽（圖3C）。表明經(jīng)高濃度6-BA處理后，赤霉素對萌動的外植體的側(cè)芽增殖起促進作用。

2.6 6-BA、NAA組合對濕地松新抽芽初代誘導的影響

試驗結(jié)果顯示，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA（圖4F）和GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA（圖4H）成功誘導出側(cè)芽或不定芽，增殖出的側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好（圖5），其余處理的外植體在培養(yǎng)過程中有的褐化死亡；有的長出小芽點（圖4B、4E），后期死亡。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，在4月中下旬采集的外植體比其他時間段采集的成活率高很多，為最佳采集時間。褐變是由于外植體中的多酚氧化酶被激活，使細胞的代謝發(fā)生變化，酚類物質(zhì)被氧化后產(chǎn)生呈棕褐色的醌類物質(zhì)，它們會逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，毒害培養(yǎng)的材料[5]。褐變的影響因素極其復雜，隨著植物種類、基因型、外植體的部位及生理狀況等的不同，危害程度也有區(qū)別[6]。許多研究表明，選擇適當?shù)耐庵搀w和培養(yǎng)條件是克服褐變的最主要手（下轉(zhuǎn)第165頁）

段。VC作為抗氧化劑有一定的抗褐變功能，本試驗結(jié)果表明添加20 mg/L的VC對濕地松新抽芽的褐化有一定抑制作用。VC一般使用濃度為5 mg/L，本試驗高出3倍，可能是由于材料類型、年齡等不同對VC的敏感度不同的原因。由于6-BA具有高效、穩(wěn)定、廉價和易于使用等特點，因而被廣泛采用，并且是組織培養(yǎng)中最常用的細胞分裂素。6-BA的主要作用是促進芽的形成，也可以誘導愈傷組織發(fā)生。

張慶瑞等[7]研究表明，GA3具有打破芽休眠的生理作用，是影響芍藥莖尖啟動培養(yǎng)的主要因素，在一定的濃度范圍內(nèi)隨著GA3濃度的提高，啟動率也相應增加。GA3與6-BA混合使用時芍藥芽萌動快，且利于芽的高生長。張曉英等[8]研究表明，BA和IBA與GA3 配合使用有利于樹莓芽的誘導和生長。本試驗結(jié)果表明，6-BA的濃度為7 mg/L時，外植體的萌動最明顯，其他濃度有稍微的萌動；GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3對經(jīng)高濃度6-BA處理后萌動的外植體的側(cè)芽增殖起促進作用。GD+4 mg/L 6-BA+NAA 0.2 mg/L+0、1、3、5 mg/L GA3的培養(yǎng)基均對新采集的外植體側(cè)芽的誘導沒有促進作用。6-BA、NAA組合試驗表明，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功誘導出側(cè)芽或不定芽，增殖出的側(cè)芽在后期培養(yǎng)中生長良好。由于試驗材料有限，本試驗未獲得大量側(cè)芽，同時也說明了濕地松側(cè)芽增殖的條件是復雜的，要建立高效穩(wěn)定的側(cè)芽增殖體系，還需要做進一步的研究。

4 參考文獻

[1] 唐巍，伍美保，楊映根.植物的微體繁殖[J].植物雜志，1996，12（5）：34-35.

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[3] 朱麗華，張藝，吳小芹.濕地松的組織培養(yǎng)及植株再生[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2004，28（6）：47-51.

[4] 孫錫本，夏國京，曲芳.利用6-BA、GA3促進蘋果側(cè)芽萌發(fā)試驗研究[J].熊岳農(nóng)專學報，1997，13（2）：6-9.

[5] 潘瑞熾.植物組織培養(yǎng)[M].廣州：廣東高教出版社，2000.

[6] 繆耀梅，李開彪，葉添謀.組織培養(yǎng)過程中污染和褐化的防治[J].韶關(guān)學院學報（自然科學版），2003，24（6）：102-103.

[7] 張慶瑞，楊秋生，李永華.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對芍藥離體培養(yǎng)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報，2007，41（1）：25-28.

[8] 張曉英，董麗芬，吳成亮.赤霉素和外植體生長狀態(tài)對樹莓芽增殖的影響[J].西北林學院學報，2004，19（3）：34-35.