岳耀穩(wěn) 王麗萍 張仲友

摘要 通過(guò)常規(guī)分離方法、平板對(duì)峙培養(yǎng)法從健康煙株的根、莖、葉中分離得到內(nèi)生細(xì)菌127株，從中篩選出8株菌株對(duì)煙草黑脛病菌有明顯抗性，并對(duì)其進(jìn)行了皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)、發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)、溫室盆栽試驗(yàn)和發(fā)酵液浸種、灌根試驗(yàn)，結(jié)果表明：8個(gè)菌株培養(yǎng)液濾液中存在具有明顯抑菌作用的活性成分。以菌株wy11對(duì)煙草黑脛病的防效最好，防效為51.7%。菌株wy2發(fā)酵液浸種對(duì)煙草幼苗有顯著促生作用，能顯著提高地上部分鮮重、莖圍、根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉寬。

關(guān)鍵詞 煙草黑脛病病原菌；內(nèi)生細(xì)菌；分離鑒定；促生作用

中圖分類號(hào) S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）09-0120-03

煙草黑脛病是土傳真菌病害，在我國(guó)各產(chǎn)煙省均有不同程度的發(fā)生[1]。篩選有益的內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌等加以利用[2]。因此，通過(guò)對(duì)皖南各煙區(qū)大量采樣，分離出多種內(nèi)生細(xì)菌，篩選出有效的黑脛病拮抗菌株，并對(duì)其促生作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 供試煙草品種及菌株

內(nèi)生細(xì)菌為云煙87、云煙97、云煙99、K326共4個(gè)品種的煙草植株成熟期的根、莖及不同生長(zhǎng)期的葉片等組織進(jìn)行采樣并分離獲得。菌株為煙草黑脛?。ú≡┚?62。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程（大連）產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。內(nèi)生細(xì)菌分離和培養(yǎng)用改良的NA（牛肉浸膏1.0 g，酵母浸出汁3.0 g，瓊脂17.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0）、液體培養(yǎng)用LB，煙草黑脛病菌的培養(yǎng)用CA[3]。

1.3 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化、保存、編號(hào)規(guī)則

采集4個(gè)品種煙草不同生長(zhǎng)期長(zhǎng)勢(shì)良好無(wú)病煙株的葉及成熟期的根和莖，對(duì)分離菌株進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)。如cg3，數(shù)字前2個(gè)小寫英文字母分別代表分離時(shí)期、煙草器官的縮寫（表1），數(shù)字代表分離序號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草內(nèi)生細(xì)菌的分離與平板抑制作用

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大量菌落，菌落形態(tài)存在明顯差異，說(shuō)明煙草組織中不僅存在大量的內(nèi)生細(xì)菌，且內(nèi)生細(xì)菌的種類豐富（圖1）。從4個(gè)品種煙草一共分離純化出127株內(nèi)生細(xì)菌，并從中篩選出了26個(gè)菌株對(duì)煙草疫霉菌有平板拮抗作用（表2），12個(gè)菌株對(duì)煙草黑脛病菌有較強(qiáng)拮抗作用（表3），其抑菌帶清晰透明，寬度均達(dá)到5 mm以上（圖2）。

從表3、圖3可以看出，對(duì)煙草黑脛病菌抑菌活性與空白對(duì)照相比，除了cg16、cj22、wy3、wy5無(wú)顯著差異外，其余8個(gè)菌株的抑菌活性均達(dá)顯著水平。

2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效

參試菌株共8個(gè)煙草內(nèi)生細(xì)菌，分別為cg24、cj27、cj17、cj20、wy2、wy11、wy4、wy16。從表4可以看出，在接種病菌后第14天，各處理均不同程度地發(fā)病。除菌株cj27外，其他7株均顯示出一定的防病效果，為6.5%～51.7%。其中以wy11表現(xiàn)突出，病情指數(shù)為33.3，防效為51.7%。由此說(shuō)明，生防菌wy11對(duì)黑脛病的防效最佳。

2.3 拮抗細(xì)菌的促生作用測(cè)定

2.3.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)種子萌發(fā)及根長(zhǎng)的影響。選擇對(duì)煙草黑脛病菌有較強(qiáng)拮抗活性的8個(gè)分離菌株為測(cè)試菌株，發(fā)現(xiàn)8株細(xì)菌菌液處理的煙草種子都能正常發(fā)芽和生長(zhǎng)，表明8株細(xì)菌不是煙草的致病菌。表5顯示各菌液處理組發(fā)芽率與對(duì)照無(wú)差異，說(shuō)明8個(gè)菌株菌液處理對(duì)種子萌發(fā)沒(méi)有顯著影響。14 d后測(cè)量根系長(zhǎng)度，結(jié)果表明，大部分菌株對(duì)根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，根長(zhǎng)都高于對(duì)照。菌液處理組煙苗根長(zhǎng)分別增長(zhǎng)0.9%～30.3%（表5）。尤以wy2最為明顯，總根長(zhǎng)達(dá)30.1 cm。利用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在α=0.05水平上，wy2的促進(jìn)作用最顯著。根長(zhǎng)比LB對(duì)照增加30.3%，與清水（CK）和LB對(duì)照相比，差異達(dá)到顯著水平（圖4）。由此可見(jiàn)，wy2浸種處理后，對(duì)煙草有明顯的促生作用，表現(xiàn)為顯著的促進(jìn)根伸長(zhǎng)，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的意義[4-6]。

2.3.2 拮抗細(xì)菌培養(yǎng)液灌根對(duì)煙草苗期生長(zhǎng)的影響。經(jīng)內(nèi)生細(xì)菌10倍wy2發(fā)酵液浸種處理后，相比10倍LB和清水對(duì)照，煙草幼苗地上部分鮮重、根長(zhǎng)、莖圍、最大葉長(zhǎng)、葉寬均有一定程度的增加。從表6可以看出，地上部分鮮重、根長(zhǎng)、莖圍與對(duì)照間差異性達(dá)到顯著水平。表明內(nèi)生細(xì)菌wy2發(fā)酵液對(duì)煙草幼苗有明顯的促生作用，有利于植株后期的健康生長(zhǎng)（圖5、6）。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，除菌株cj27外，其他7株內(nèi)生細(xì)菌處理均顯示出一定的防病效果，其中以wy11表現(xiàn)突出。大部分拮抗內(nèi)生細(xì)菌菌液對(duì)根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，尤以wy2最為明顯，其發(fā)酵液對(duì)煙草幼苗有明顯的促生作用。通過(guò)篩選，獲得了1株有一定防病效果的內(nèi)生細(xì)菌wy11，對(duì)煙草黑脛病的生物防治研究具有一定的指導(dǎo)意義[7-8]。因此，wy11和wy2菌株在煙草防病促生方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其實(shí)用發(fā)酵條件、防病促生機(jī)理、大田應(yīng)用效果等還需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 孔凡玉，朱賢朝，石金開(kāi)，等.我國(guó)煙草侵染性病害發(fā)生趨勢(shì)及防治對(duì)策[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1995（1）：31-34.

[2] 劉峰，蔣宇揚(yáng)，劉世英，等.植物內(nèi)生菌抗蟲(chóng)工程研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2004，15（4）：417-419.

[3] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：49.

[4] 林玲，喬勇升，顧本康，等.植物內(nèi)生細(xì)菌及其生物防治植物病害的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（6）：969-974.

[5] 馬冠華，周常勇，肖崇剛，等.煙草內(nèi)生細(xì)菌Itb57的鑒定及其對(duì)煙草黑脛病的防治效果[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010（2）：148-152.

[6] 蔣繼志，張蕾，劉璇，等.致病疫霉拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選及離體防病作用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（2）：75-79.

[7] 楊海蓮，孫曉璐.植物根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性的研究進(jìn)展[J].植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（2）：106-110.

[8] 王萬(wàn)能，全學(xué)軍，肖崇剛.煙草內(nèi)生細(xì)菌對(duì)煙草病害的拮抗和防治作用[J].煙草科技，2006（1）：54-57.