石金禮，張言誠(chéng)，張力浩，周　靜，周麗娜，李輝信，胡　鋒，徐　莉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)物性能研究

石金禮，張言誠(chéng)，張力浩，周靜，周麗娜，李輝信，胡鋒，徐莉*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

篩選獲得一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，經(jīng)生理生化與16S rDNA鑒定，獲得菌株為銅綠假單胞菌147（Pseudomonas aeruginosa 147）。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)薄層色譜、紅外掃描分析其發(fā)酵產(chǎn)物為糖脂類生物表面活性劑（Biosurfactant，BS），單因素最佳發(fā)酵條件優(yōu)化為碳源、氮源和碳氮比分別為花生油、硫酸銨和25∶1，最佳培養(yǎng)溫度為30℃，pH值為8，NaCl濃度為5 g·L-1。在最佳條件下培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液的表面張力值比原來(lái)降低了42.08 mN·m-1，且能平穩(wěn)保持至144 h。在108 h細(xì)菌生物量最大，為2.63 g·L-1，此時(shí)產(chǎn)生的糖脂最多，可達(dá)2.02 g·L-1。生物表面活性劑對(duì)不同環(huán)數(shù)的多環(huán)芳烴類物質(zhì)（熒蒽、芘、苯［a］芘）的增溶效果實(shí)驗(yàn)表明：隨生物表面活性劑添加量的增大，不同PAHs溶解度均增大；相同濃度生物表面活性劑添加條件下，高環(huán)多環(huán)芳烴（苯［a］芘）的增溶效果低于低環(huán)多環(huán)芳烴（熒蒽、芘）。

生物表面活性劑；多環(huán)芳烴；發(fā)酵條件優(yōu)化；增溶

石金禮，張言誠(chéng)，張力浩，等.生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)物性能研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（9）：1717-1726.

SHI Jin-li，ZHANG Yan-cheng，ZHANG Li-hao，et al.Screening of a biosurfactant-producing bacterium and biosurfactant characteristics［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（9）：1717-1726.

多環(huán)芳烴（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs）是一類由2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)組成的稠環(huán)化合物。其水溶性低，易吸附于固體顆粒，能夠長(zhǎng)期存在于環(huán)境中，是一類持久性有機(jī)污染物［1-2］，也是美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局（U.S.Environmental Protection Agency）確定的優(yōu)先控制的污染物。由于PAHs高脂溶性，低生物可利用性，使得人們將其用于環(huán)境中的修復(fù)措施和效果存在局限。因此通過(guò)利用表面活性劑的膠團(tuán)化作用，顯著提高疏水性有機(jī)化合物在水相中的表觀溶解度，從而提高其生物有效性，促進(jìn)修復(fù)效果的表面活性劑強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)（Surfactant enhanced remediation，SER）引起人們的關(guān)注［3-5］。

目前在有機(jī)污染修復(fù)過(guò)程中使用的多為化學(xué)表面活性劑。由于化學(xué)表面活性劑不易降解、易造成二次污染、對(duì)土壤微生物產(chǎn)生毒害風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在環(huán)境修復(fù)中的應(yīng)用［6］。生物表面活性劑以其具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液等的作用，其主要成分糖脂、磷脂、脂蛋白或脂肽類化合物、高分子化合物和脂多糖，能夠被生物完全降解，安全無(wú)毒，且用量少，發(fā)酵成本低，逐漸成為研究熱點(diǎn)［7］。已有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)篩選產(chǎn)表面活性劑的細(xì)菌，并將其應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染的修復(fù)［8］。

生物表面活性劑合成方式包括動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)提取法、酶合成法、微生物發(fā)酵法。然而，動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)提取法受到原料來(lái)源的制約，難以大規(guī)模生產(chǎn)，酶合成法所用酶制劑的價(jià)格亦極大限制了其發(fā)展。相比而言，微生物發(fā)酵以其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)安全的特點(diǎn)，成為重要的生物表面活性劑來(lái)源。目前，已有很多微生物被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，如細(xì)菌類球擬酵母（Torulopsis bombicola）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerug-inosa）［9］，其中銅綠假單胞菌已有Pseudomonas cepacia CCT6659［10］、Pseudomonas aeruginosa S6［11］等見(jiàn)諸報(bào)道。它們產(chǎn)生的生物表面活性劑是目前在多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)，石油污染修復(fù)等應(yīng)用較多［12］，生物表面活性劑在增溶多環(huán)芳烴時(shí)具有生物降解性、低毒性、適應(yīng)極端環(huán)境的優(yōu)勢(shì)［13］。

本研究以PAHs為目標(biāo)污染物，篩選產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，并分析發(fā)酵產(chǎn)物為生物表面活性劑，優(yōu)化發(fā)酵條件，探討菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑對(duì)典型多環(huán)芳烴熒蒽、芘、苯［a］芘的增溶作用，研究結(jié)果將為PAHs污染環(huán)境的修復(fù)技術(shù)研究提供菌株資源和基礎(chǔ)理論支撐。

1　材料與方法

1.1供試土壤

采集南京煉油廠附近土樣、北京某加油站附近土樣、南京某河底淤泥和南京某湖底淤泥為土壤樣品。

1.2供試培養(yǎng)基與試劑

富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO410.00 g，KCl 1.10 g，KH2PO43.40 g，K2HPO44.40 g，MgSO40.50 g，EDTA 1.00 g，酵母粉0.50 g，液體石蠟5.00 mL，pH 7.0～7.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，用蒸餾水定容到1.00 L。

LB液體培養(yǎng)基：10.00 g蛋白胨，5.00 g酵母粉，10.00 g氯化鈉，用無(wú)菌水定容至1.00 L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基加入15.00～ 20.00 g瓊脂粉。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.00 g，NaCl 10.00 g，KH2PO40.20 g，K2HPO40.80 g，MgCl20.50 g，CaCl20.05 g，F(xiàn)eCl20.01 g。

血平板培養(yǎng)基：購(gòu)自南京便診生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑：甲醇為色譜純，花生油為食用級(jí)，其他試劑均為分析純。

1.3細(xì)菌篩選和鑒定

1.3.1表面活性劑產(chǎn)生菌血平板初篩

取5.00 g新鮮土樣置于裝有45 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，待培養(yǎng)液混濁后，吸取5 mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新的富集培養(yǎng)基中，按上述條件培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3次。后經(jīng)濃度梯度稀釋，100μL涂布于血平板，30℃培養(yǎng)48h，選擇透明圈較大的菌落，分離純化，4℃保存。

1.3.2表面張力儀復(fù)篩

將上述純化的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，200 r·min-1、30℃培養(yǎng)96 h后，用表面張力儀測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液的表面張力［14］。

1.3.3細(xì)菌鑒定

基于細(xì)菌形態(tài)與生理生化結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》做出初步鑒定。同時(shí)將菌株用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心法收集菌體，并采用SDS-CTAB法提取總基因組DNA，以細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，運(yùn)用分子學(xué)鑒定菌株［15］。

1.4生物表面活性劑的提取、鑒定和臨界膠束濃度測(cè)定

取培養(yǎng)72 h的細(xì)菌發(fā)酵液在4℃、5000×g離心30 min，取上清液用1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為2.0，然后加入等體積的三氯甲烷/甲醇（2∶1，V∶V）混勻，萃取三次合并有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥后，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到淺黃色漿狀物，即為生物表面活性劑粗產(chǎn)物［10］。

薄層色譜：取0.2 g提取的上述粗產(chǎn)物溶于1 mL的氯仿中，點(diǎn)樣于硅膠G板進(jìn)行薄層色譜分析，三氯甲烷/甲醇/水（65∶15∶1，V∶V）為展開(kāi)劑，用不同的顯色劑顯色。（1）苯酚-硫酸試劑：3 g苯酚與5 mL硫酸溶解于95 mL乙醇中，如果顯棕色斑點(diǎn)，則有糖脂存在，反之糖脂不存在；（2）茚三酮顯色劑：0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中，如果斑點(diǎn)顯紅色，則有脂肽存在，反之脂肽不存在［16-17］。

紅外掃描分析（Fouriertransforminfraredspectrometer，F(xiàn)T-IR）：將生物表面活性劑粗產(chǎn)品溶于三氯甲烷后，在制備型硅膠薄板上進(jìn)行分離，依照顯色帶位置刮下目的硅膠層，用三氯甲烷/甲烷（1∶1，V∶V）提取后于40℃下減壓蒸干，得到部分純化的生物表面活性劑。將上述生物表面活性劑溶于甲醇，采用KBr壓片法（1～2 mg樣品+200 mgKBr，干燥處理后研細(xì)），混合壓成透明薄片后紅外掃描分析測(cè)定［18-20］。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度測(cè)定（Critical micelle concentration，CMC）：精確稱取上述提取所得的產(chǎn)物粗品溶于蒸餾水中，配制成不同濃度梯度（0～500 mg·L-1）的產(chǎn)物溶液，測(cè)定溶液的表面張力，并依據(jù)表面活性劑濃度-表面張力曲線求得臨界膠束濃度值。

1.5細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1測(cè)定指標(biāo)

發(fā)酵液表面張力值以吊環(huán)法測(cè)定［21］，乳化性能采用超聲體積比法測(cè)定［22］。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集菌體，于105℃烘干至恒重后稱重，以菌體干重表示生物量。發(fā)酵液培養(yǎng)后，離心收集上清液，用等體積乙酸乙酯萃取2次后，45℃減壓蒸干，將殘余物溶于等體積的0.05 mol·L-1NaHCO3中，以硫酸苯酚法［23］測(cè)定糖脂含量。

1.5.2碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入10 g·L-1的葡萄糖、甘油、花生油、可溶性淀粉、液體石蠟、麥芽糖、乳糖、蔗糖（對(duì)照組不加碳源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.3氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

以碳源實(shí)驗(yàn)中獲得的最優(yōu)碳源作為選定碳源，取10 g碳源加入1 L不含（NH4）2SO4無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述培養(yǎng)基，分別加入2 g·L-1的硝酸鈉、硫酸銨、脲、硝酸銨（對(duì)照組不加氮源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.4碳氮比對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL含不同碳氮源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。固定氮源為2 g·L-1，分別加入已優(yōu)化的碳源，控制比例為1、5、10、15、20、25、30、35、40（對(duì)照組不加氮源）。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.5溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。控制搖床溫度在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.6 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基?？刂婆囵B(yǎng)基pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.7NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)生表面活性劑的影響

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基?？刂婆囵B(yǎng)基NaCl濃度為0、5、10、15、20、25、30、50、80、120、160 g·L-1。3 d后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.5.8菌株147發(fā)酵動(dòng)態(tài)圖

取150 mL三角瓶，每瓶中加入50 mL上述已優(yōu)化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。在12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h后分別測(cè)定發(fā)酵液的表面張力值、乳化性、生物量、糖脂含量。每個(gè)處理三次重復(fù)。

1.6生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴增溶效果

25 mL三角瓶中加入過(guò)量的苯并［a］芘、芘、熒蒽和10 mL不同濃度的生物表面活性劑粗產(chǎn)物溶液，然后加入0.02%的疊氮化鈉抑制微生物的生長(zhǎng)。蓋好塞子并用封口膜封口后，25℃、50 r·min-1振蕩48 h后，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中5000 r·min-1離心15 min，取上清液加入等體積的二氯甲烷∶正己烷=1∶1（V∶V）萃取3次，收集洗脫液并于40℃濃縮至干，用甲醇定容到2 mL，過(guò)0.22 μm孔徑濾膜后HPLC分析［24］。

2　結(jié)果與討論

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)血平板初篩得到25株菌株，表1是表面張力儀復(fù)篩結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)147號(hào)細(xì)菌發(fā)酵液的張力值明顯低于其他菌株，選擇147細(xì)菌作為目標(biāo)菌株。

觀察菌株培養(yǎng)特征及形態(tài)特征，可見(jiàn)菌體細(xì)長(zhǎng)且長(zhǎng)短不一，菌落較小，為扁平、濕潤(rùn)的菌落。部分生理生化指標(biāo)如表 2。經(jīng) 16S rDNA測(cè)試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號(hào)進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%，采用MEGA 5.10軟件NJ方法構(gòu)建147的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。結(jié)合生理生化特征結(jié)果，將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株 GenBank登錄號(hào)為KU921686。

表1　細(xì)菌復(fù)篩結(jié)果Table 1 Bacterium screening

表2　147菌株的生理生化特性Table 2 Physiological characteristics of strain 147

2.2147細(xì)菌產(chǎn)生表面活性劑的物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)薄層色譜分析顯示，苯酚-硫酸試劑有棕色斑點(diǎn)，加入茚三酮顯色劑則無(wú)明顯變化。這說(shuō)明該菌株主要產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生少量的脂肽類物質(zhì)。

將菌株147產(chǎn)物提純，紅外光譜儀（FT-IR）分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2。該物質(zhì)在3701.72cm-1處有吸收峰，表明分子中有羥基存在；2 858.77～2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類C-H的伸縮振動(dòng)，1400～1200 cm-1處是C-H變角振動(dòng)，1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動(dòng)，而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動(dòng)，因此該物質(zhì)中有一個(gè)五元環(huán)狀內(nèi)酯和糖苷鍵存在。由此進(jìn)一步證明該生物表面活性劑含糖脂類物質(zhì)。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度（Critical micelle0.005 concentration，CMC）可以作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC越小，改變表/界面性質(zhì)，起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出：糖脂在0～300 mg·L-1時(shí)，表面張力值隨著糖脂濃度的升高而降低，且在300 mg·L-1時(shí)達(dá)到最小值；在300～500 mg·L-1時(shí)，表面張力值變化不大?？傻冒l(fā)酵粗提產(chǎn)物的CMC為300 mg·L-1，明顯低于普通化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的2200 mg·L-1［25］，能在較低濃度下使用，因而在醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)具有廣闊應(yīng)用前景。

圖1　147菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree established using the neighbor-joining method，based on 16S rDNA sequence of strain 147 and the related strains

圖2　147菌株產(chǎn)的生物表面活性劑紅外光譜圖Figure 2 Fourier transform infrared spectrum of biosurfactant produced by strain 147

圖3　不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力Figure 3 Surface tensions of biosurfactant solution at different concentrations

2.3147細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1碳源的影響

碳源對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)與發(fā)酵產(chǎn)物量有重要影響。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可在多種類型碳源下產(chǎn)生生物表面活性劑，包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知，以花生油為碳源，細(xì)菌發(fā)酵液的降低值為39.12 mN·m-1，明顯高于其他碳源類型；乳化值為34.17%，稍高于其他碳源，此時(shí)細(xì)菌生物量最大，糖脂含量最高，為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源，能夠促進(jìn)菌株產(chǎn)生更多生物表面活性劑，但如果用于實(shí)際生產(chǎn)，成本相對(duì)較高，近年來(lái)一些研究者嘗試使用成本較低的工業(yè)副產(chǎn)物如糖蜜、廢潤(rùn)滑油等作為碳源，發(fā)現(xiàn)也具有很好的促進(jìn)微生物產(chǎn)生生物表面活性劑的作用［26］。因此，后期會(huì)考慮選擇用一些低成本碳源進(jìn)行發(fā)酵。

2.3.2氮源的影響

細(xì)胞表面的物質(zhì)合成需要氮源，氮源的種類會(huì)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生很大影響［27］。由表4可以看出，不同氮源對(duì)細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中表面張力降低值的影響較小，可能與發(fā)酵液中的生物表面活性劑含量已經(jīng)達(dá)臨界膠束濃度（CMC）有關(guān)［28-29］。當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時(shí)發(fā)酵液表面張力降低值最大，同時(shí)乳化性、細(xì)菌干重、糖脂含量均達(dá)到最大值。這與錢曉勇等［30］研究結(jié)果一致，硫酸銨是促進(jìn)生物表面活性劑生成的較好氮源。

表3　碳源對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of carbon sources on growth and biosurfactant production by strain 147

表4　氮源對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of nitrogen source on growth and biosurfactant production by strain 147

2.3.3碳氮比的影響

由表5可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比在5以上時(shí)，表面張力降低值與乳化性變化不大，而細(xì)菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同，說(shuō)明當(dāng)碳氮比大于5時(shí)，該菌株生物表面活性劑產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)臨界膠束濃度。細(xì)菌干重在碳氮比為25時(shí)最大，為2.58±0.09 g·L-1，同時(shí)生物表面活性劑含量也達(dá)到最大，為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等［26］研究結(jié)果一致，25是147菌株的最適生長(zhǎng)碳氮比，此時(shí)細(xì)菌的生物量達(dá)到最高，生物表面活性劑產(chǎn)量也最高。

2.3.4溫度的影響

溫度是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素之一。不同細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度不同。一般細(xì)菌在4℃停止生長(zhǎng)，在30℃左右生長(zhǎng)良好。已報(bào)道的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）最適溫度一般在27～37℃［31-32］。由圖4可以看到，表面張力值、生物量和生物表面活性劑產(chǎn)量都隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在30℃時(shí)達(dá)到最大。乳化性在15℃到30℃時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定，在30℃到40℃時(shí)乳化性降低。實(shí)際上大多數(shù)銅綠假單胞菌的最佳培養(yǎng)溫度都在27～37℃［31］，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖4　溫度對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 4 Effect of temperature on growth and biosurfactant production by strain 147

表5　碳氮比對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Table 5 Effect of C∶N ratio on growth of and biosurfactant production by strain 147

2.3.5pH的影響

pH值也是影響菌株發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的因素之一。由圖5可見(jiàn)，細(xì)菌的生物量在pH=8的時(shí)候達(dá)到最大，且在pH8～10的時(shí)候基本平穩(wěn)；表面張力值、生物表面活性劑含量與乳化性均在pH=8的時(shí)候達(dá)到最大值，兩側(cè)均有不同程度的下降。因此該菌株傾向偏堿性的條件生存，與強(qiáng)婧等［11］篩選的Pseudomonas aeruginosa S6最適pH一致。綜合其他報(bào)道的生物表面活性劑產(chǎn)生菌的最適pH范圍，大部分微生物都在pH6.2～8之間。

2.3.6NaCl濃度的影響

圖5　pH對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 5 Effect of pH on growth of and biosurfactant production by strain 147

圖6　NaCl濃度對(duì)147細(xì)菌生長(zhǎng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響Figure 6 Effect of NaCl concentrations on growth of and biosurfactant production by strain 147

NaCl濃度通過(guò)改變細(xì)胞滲透壓影響微生物的生長(zhǎng)與代謝［33-34］，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。由圖6可見(jiàn)，鹽濃度在0～5 g·L-1之間，細(xì)菌生長(zhǎng)受到促進(jìn)，而當(dāng)鹽濃度大于5 g·L-1時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，糖脂量與生物量趨勢(shì)一致。菌株的生物量、生物表面活性劑量、表面張力值與乳化性均在鹽濃度為5 g·L-1時(shí)呈現(xiàn)最大，說(shuō)明該菌株具有一定的耐鹽性，與強(qiáng)婧等［11］研究的生物表面活性劑產(chǎn)生菌Pseudomonas aeruginosa S6也能夠耐鹽相似。此外，本菌株在最高為25 g·L-1的鹽濃度條件下依然能夠存活，但此時(shí)已不能產(chǎn)生更多的生物表面活性劑。

2.3.7細(xì)菌發(fā)酵動(dòng)態(tài)

在上述花生油25 mL·L-1為碳源、硫酸銨1 g·L-1為氮源、NaCl濃度為5 g·L-1、pH=8、溫度保持為30℃的最佳培養(yǎng)條件下，追蹤細(xì)菌147的發(fā)酵動(dòng)態(tài)（圖7）。菌株經(jīng)過(guò)短暫的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，108 h后進(jìn)入穩(wěn)定增長(zhǎng)期，此時(shí)菌體所產(chǎn)生的生物表面活性劑含量達(dá)到最大，此后生物表面活性劑含量減少，可能是因?yàn)楹笃谂囵B(yǎng)基內(nèi)的碳源已經(jīng)用盡，細(xì)菌開(kāi)始以胞外分泌物糖脂為碳源維持生命。而表面張力值與乳化性在24 h后達(dá)到最大，之后維持在穩(wěn)定水平，說(shuō)明細(xì)菌在24 h后產(chǎn)生的生物表面活性劑已到達(dá)生物表面活性劑的臨界膠束濃度，此后生物表面活性劑產(chǎn)量還會(huì)增加，但是表面張力降低值與乳化性只維持在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。

圖7　銅綠假單胞菌147菌株的發(fā)酵動(dòng)態(tài)Figure 7 Dynamic curves of Pseudomonas aeruginosastrain 147 fermentation

最佳培養(yǎng)條件下，本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌生物量最高能達(dá)到5.22 g·L-1（表6），生物表面活性劑量達(dá)到5.09 g·L-1。相對(duì)已報(bào)道的幾株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）合成生物表面活性劑的產(chǎn)率在2.12～15.92 g·L-1范圍內(nèi)，本菌株的產(chǎn)表面活性劑能力居中。

表6　幾株銅綠假單胞菌合成生物表面活性劑的產(chǎn)率比較Table 6 Comparison of biosurfactant production by several Pseudomonas aeruginosa strains

2.4生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴增溶效果

圖8是水相中多環(huán)芳烴（苯并［a］芘、芘、熒蒽）的表觀溶解度隨著生物表面活性劑濃度的變化曲線，當(dāng)生物表面活性劑濃度大于300 mg·L-1時(shí)，各多環(huán)芳烴的濃度隨生物表面活性劑濃度增大而增大。這是由于生物表面活性劑在CMC（臨界膠束濃度）以上時(shí)會(huì)形成膠束，而膠束內(nèi)的疏水性微環(huán)境對(duì)疏水性有機(jī)溶劑具有較強(qiáng)的分配作用，可顯著增大溶質(zhì)的表觀溶解度［40］；當(dāng)生物表面活性劑濃度低于CMC時(shí)，生物表面活性劑分子以單體形式存在，單分子的表面活性劑對(duì)被增溶物的分配作用很弱，因而各多環(huán)芳烴在水中的溶解度變化不大或者輕微增加。

此外，由圖8可得生物表面活性劑對(duì)三種多環(huán)芳烴均具有增溶效果，且在0～300 mg·L-1增溶效果不明顯，在300～500 mg·L-1增溶明顯；四環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五苯環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低，與楊建剛等［41］的研究結(jié)果一致。這可能的原因是與多環(huán)芳烴的正辛醇-水分配系數(shù)（Octanol-water partioning coefficient，Kow）相關(guān)，熒蒽Kow＜芘Kow＜苯并［a］芘Kow［42］，即Kow值越大的多環(huán)芳烴，增溶效果越低。

圖8　生物表面活性劑多環(huán)芳烴的增溶作用Figure 8 Solubilization of polycyclic aromatic hydrocarbons by biosurfactant

3　結(jié)論

本研究篩選獲得了一株產(chǎn)生生物表面活性劑的147菌株，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物主要為糖脂類生物表面活性劑。以產(chǎn)生物表面活性劑量的能力為指標(biāo)，在本研究的發(fā)酵條件下，該菌株的最適碳、氮源分別為花生油與硫酸銨，最適碳氮比為25∶1，最適發(fā)酵溫度為30℃，最適鹽濃度為5 g·L-1，最適pH值為8。在上述最適培養(yǎng)條件下，該菌株的細(xì)菌生物量最高達(dá)到5.22 g·L-1，生物表面活性劑量達(dá)到5.09 g·L-1，而且該細(xì)菌能夠在偏堿性（pH值為8～13）條件下生存，具有耐鹽堿的特性。多環(huán)芳烴的溶解度隨表面活性劑的濃度增大而增大，生物表面活性劑對(duì)三環(huán)熒蒽、四環(huán)芘、五環(huán)苯并［a］芘的增溶效果隨著環(huán)數(shù)的增加而降低。實(shí)驗(yàn)表明，147菌株產(chǎn)生物表面活性劑性能突出，可進(jìn)一步研究用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。生物表面活性劑對(duì)多環(huán)芳烴污染土壤具有增溶效果，該菌株可接入多環(huán)芳烴污染的土壤增溶多環(huán)芳烴促進(jìn)土著微生物修復(fù)。該菌株具有耐鹽、耐堿等特性，應(yīng)用前景廣闊。

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Screening of a biosurfactant-producing bacterium and biosurfactant characteristics

SHI Jin-li，ZHANG Yan-cheng，ZHANG Li-hao，ZHOU Jing，ZHOU Li-na，LI Hui-xin，HU Feng，XU Li*（College of Resources and Environment Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

A biosurfactant-producing bacterium was isolated and identified as Pseudomonas aeruginosa 147 by physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequencing.The fermentation products were assigned to glycolipid by Thin Layer Chromatography（TLC）and Fourier Transform Infared Spectroscopy（FT-IR）analysis.The optimal conditions for the strain to produce biosurfactants were peanut oil as initial carbon source，（NH4）2SO4as nitrogen source，carbon to nitrogen ratio of 25∶1，pH 8，temperature of 30℃，and 5 g·L-1NaCl.Under these conditions，the surface tension of the fermentation broths could be reduced by 42.08 mN·m-1，compared with the control，and stayed stable for 144 hours.During 108 hours of incubation，the bacterium achieved the maximum biomass（2.63 g·L-1）and had the maximum fermentation product（2.02 g·L-1）.The solubilization of different polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）（fluoranthene，pyrene，benzene［a］pyrene）was increased with the addition of the fermentation products.At the same rates of fermentation products，enhanced solubilization of PAHs with high-ring（benzene［a］pyrene）was lower than that with low-ring（fluoranthene，pyrene）.

bio-surfactant；polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）；fermentation optimization；solubilization

X53

A

1672-2043（2016）09-1717-10doi：10.11654/jaes.2016-0204

2016－02－21

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41101292，41371469）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201503121）；安徽省博士后研究人員科研活動(dòng)資助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（2015 B057）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016M591856）；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（y201056）；以及江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目和江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心的資助

石金禮（1989—），男，山東濰坊人，碩士研究生，從事多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)。E-mail：2013130303@njau.edu.cn

徐莉 E-mail：xuli602@njau.edu.cn