岳進(jìn)華，劉鶴媛，周　銘，高　洋，楊啟明，李雯麗，陳德坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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大熊貓犬瘟熱病毒LG株的分離鑒定

岳進(jìn)華，劉鶴媛，周銘，高洋，楊啟明，李雯麗，陳德坤*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為獲得大熊貓犬瘟熱病毒株，采集死亡大熊貓的心臟、肺、肝病料，研磨并反復(fù)凍融后收集上清液接種Vero細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)后，收集病毒液。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)鑒定病毒分離株，測(cè)定病毒TCID50，動(dòng)物回歸試驗(yàn)測(cè)定其毒力。結(jié)果顯示，盲傳到第5代時(shí)，Vero細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、聚集、脫落等病變；PCR擴(kuò)增出287 bp片段，與預(yù)期相符；測(cè)序結(jié)果顯示,該毒株與已發(fā)表的CDV SD (14) 11毒株(亞洲-Ⅰ型)的同源性為98%；毒株的TCID50為10-5.2/mL；幼犬感染分離毒株后出現(xiàn)體溫升高、鼻頭發(fā)干、拉稀、眼鼻分泌出水樣分泌物等癥狀。本研究成功分離出大熊貓?jiān)慈翢岵《局辍?/p>

犬瘟熱病毒；大熊貓；分離鑒定

犬瘟熱(Canine distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，有較高發(fā)病率和病死率，臨床上以厭食、雙相熱、結(jié)膜炎、嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為典型特征[1-3]。犬瘟熱分布于世界各地，感染宿主的范圍也日益擴(kuò)大，珍稀動(dòng)物如大熊貓、小熊貓、伊比利亞猞猁等也被報(bào)道感染[4-5]。1983年張振興等報(bào)道CDV感染大熊貓[6]。1997年，胡貴學(xué)等[7]報(bào)道犬瘟熱病毒感染大熊貓且引起死亡。2014年12月—2015年5月樓觀臺(tái)陜西秦嶺大熊貓繁育基地相繼有5只大熊貓因感染犬瘟熱病毒死亡。但未見有從死亡大熊貓中分離犬瘟熱病毒的報(bào)道。本研究采集死亡大熊貓心臟、肺、肝病料進(jìn)行了病毒分離，經(jīng)過(guò)在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和測(cè)序鑒定，證明分離出1株犬瘟熱病毒。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料死亡大熊貓的心臟、肝臟、肺，來(lái)自陜西秦嶺樓觀臺(tái)大熊貓繁育基地。

1.1.2細(xì)胞株非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero細(xì)胞系)，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑MEM培養(yǎng)液、犢牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、EDTA二鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；RNAiso Plus、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Easy-TaqDNA 聚合酶、dNTPs、10×EasyTaqbuffer、DNA MarkerⅠ，北京全式金公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病料處理將臟器剪碎后，放入無(wú)菌玻璃研磨器中研磨，隨后加入5倍體積的PBS(含100 mg/mL雙抗)充分混勻，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 μm濾膜除菌，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒分離培養(yǎng)

1.2.2.1Vero細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的Vero細(xì)胞，培養(yǎng)液含為100 mL/L犢牛血清和10 mg/mL雙抗的MEM。待細(xì)胞鋪滿90%時(shí)，用2.5 g/L胰酶進(jìn)行消化傳代，然后將細(xì)胞瓶放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2.2病毒分離將Vero細(xì)胞培養(yǎng)液棄去,以無(wú)血清MEM洗滌3遍，按細(xì)胞培養(yǎng)液10%的量接種處理好的病料，37℃作用1 h，棄去病料處理液，加入細(xì)胞維持液(含20 mL/L犢牛血清和10 mg/mL雙抗的MEM)。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d～5 d，連續(xù)觀察細(xì)胞接毒后的狀態(tài)。盲傳至細(xì)胞出現(xiàn)CPE。

1.2.3病毒鑒定

1.2.3.1病毒RNA提取將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次，離心取500 μL上清，加入500 μL RNAiso Plus充分混勻，室溫靜置5 min；加入1/5體積的預(yù)冷氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫下放置5 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相至另一新的EP管，加入等體積預(yù)冷異丙醇混勻，室溫放置10 min；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL 750 mL/L乙醇(DEPC水新配制)；4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥沉淀2 min～5 min，加入6 μL～8 μL RNase-free水溶解RNA，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄或置-80℃保存。

1.2.3.2反轉(zhuǎn)錄在RNase-free PCR管里配制6 μL RNA/引物混合液：模板RNA(1 ng～1 μg)，Random Primers(25 μmol/L)1 μL ，RNase free dH2O 5 μL。上述混合物70℃孵育10 min，即刻放于冰上急冷2 min以上。瞬時(shí)離心使溶液聚集RNase-free PCR管底。上述RNase-free PCR管中配制如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×M-MLV buffer 2 μL ，dNTP Mixture 0.5 μL，RI 0.25 μL，RTase 0.25 μL，DEPC H2O 1 μL。然后于30℃反應(yīng)10 min，接著42℃保溫1 h。70℃孵育15 min后冰上冷卻，獲得cDNA于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3PCR擴(kuò)增PCR引物[8]，上游引物5′-ACAGGATTGCTGAGGACCTAT-3′；下游引物：5′-CAAGATAACCATGTACGGTGC-3′。按下列反應(yīng)體系對(duì)所提取的CDV cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系(25 μL)：模板2 μL，10×buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L引物-1 1 μL，10 μmol/L引物-2 1 μL Easy-TaqDNA Polymerase 0.25 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR循環(huán)條件為：94℃ 5 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，34個(gè)循環(huán);最后72℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物，寄送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，用DNA Star 6.0軟件MegAlign對(duì)CDV分離株與GenBank登錄的其他CDV毒株進(jìn)行比較分析。

1.2.4TCID50測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]，將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞毒以10倍倍比稀釋后，加入鋪好Vero細(xì)胞的96孔板板中，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，37℃孵育1 h后棄掉上清液，加入100 μL含20 mL/L犢牛血清和10 mg/mL雙抗MEM，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d,并觀察細(xì)胞變化。

1.2.5動(dòng)物回歸試驗(yàn)2月齡幼犬6只，分成2組，試驗(yàn)組皮下注射分離毒104TCID50，對(duì)照組注射生理鹽水，分開隔離飼養(yǎng)。每天觀察犬的精神狀況、食欲、溫度、糞便等臨床表現(xiàn)[10]。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

病毒濾液在Vero細(xì)胞上盲傳前4代細(xì)胞病變不明顯。盲傳到第5代時(shí)細(xì)胞病變(CPE)明顯，細(xì)胞接毒72 h后，細(xì)胞逐漸圓縮、拉網(wǎng)、崩解及最終脫落(圖1)。

A.正常Vero細(xì)胞；B.Vero 細(xì)胞病變

A.Normal Vero cells; B.Typical CPE in Vero cells

圖1Vero細(xì)胞病變(200×)

Fig.1CPE in Vero cells(200×)

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

出現(xiàn)CPE的細(xì)胞毒RT-PCR檢測(cè)CDV N蛋白基因，出現(xiàn)287 bp目片段(圖2)，與預(yù)期相符?；厥誔CR產(chǎn)物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，得到的基因序列，登陸GenBank Blast分析得出，分離的毒株與已經(jīng)發(fā)表的CDV SD (14) 11毒株(亞洲- Ⅰ型)的同源性為98%(圖3)。證明分離得到的病毒確實(shí)為CDV。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對(duì)照；2～4.盲傳第5代CDV；5.陽(yáng)性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-4.PCR products of CDV fifth generation;5.Positive control

圖2盲傳第5代CDV PCR鑒定結(jié)果

Fig.2Electrophoresis of PCR products of CDV fifth generation

2.3動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組攻毒第4天后，幼犬出現(xiàn)體溫升高，達(dá)到39.5℃以上,出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、眼結(jié)膜發(fā)紅、眼瞼腫脹、鼻頭發(fā)干等癥狀,相繼出現(xiàn)拉稀、眼鼻分泌出水樣分泌物。對(duì)照組幼犬一切正常。

Query.測(cè)序結(jié)果；Sbjct.參考序列(KP738610.1)

圖3序列在GenBank中Blast分析結(jié)果

Fig.3Blast results in GenBank

3　討論

犬瘟熱病毒感染大熊貓相關(guān)報(bào)道和研究較多。李金中等對(duì)大熊貓、狼、小熊貓犬、貂、貉、狐、熊、獅、虎 、壘貓和猞猁共65只動(dòng)物的病料進(jìn)行了犬瘟熱病毒的分離，從小熊貓、狐、貉和犬4種動(dòng)物的病料中分離出9株CDV，但未能從大熊貓病料中分離出CDV[11-12]。李金中等[13]從死亡大熊貓的肝臟中，對(duì)大熊貓犬瘟熱病毒融合蛋白基因3＇端的序列進(jìn)行了測(cè)定研究。Guo L等[14]和何洪彬[15]等對(duì)犬瘟熱病毒大熊貓毒株血凝蛋白(H)基因進(jìn)行了序列測(cè)定研究。大熊貓犬瘟熱病毒分離與鑒定未有報(bào)道。本試驗(yàn)成功分離鑒定出大熊貓犬瘟熱病毒LG株。

CDV適應(yīng)多種細(xì)胞培養(yǎng)物，有Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、BHK- 21細(xì)胞等[10,16]。本試驗(yàn)選用Vero細(xì)胞，經(jīng)研究者證實(shí)是適合CDV分離的首選細(xì)胞[17-18]。Vero細(xì)胞接種分離CDV后產(chǎn)生典型的CPE，可初步確定分離出病毒，但僅從CPE不能確定該病毒就是CDV，還需要進(jìn)一步鑒定。CDV的基因組具相對(duì)穩(wěn)定，因而可考慮采用PCR進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定CDV保守的衣殼蛋白基因，通過(guò)登陸GenBank BlastT分析表明，分離毒株與已經(jīng)發(fā)表的CDV SD (14) 11毒株(亞洲-1型)的同源性為98%。金藝鵬等[19]對(duì)犬瘟熱流行病毒基因組遺傳特征分析得出流行病毒與強(qiáng)毒株 MKY-KM08(狐貍)、PS(貉子)、HLJ1-06(狐貍)、Hebei(水貂)以及AC96I-H358(犬屬)親緣關(guān)系較近，屬于強(qiáng)毒株，基因型屬于Asia-1，這與本分離株相似。證明本次試驗(yàn)分離得到的病毒確實(shí)為CDV。

本次分離得到大熊貓犬瘟熱病毒陜西株的TCID50為10-5.2/mL，感染幼犬4 d后，幼犬相繼出現(xiàn)犬瘟熱臨床癥狀，說(shuō)明該毒株具有較強(qiáng)的毒力。目前為止，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有針對(duì)大熊貓犬瘟熱的疫苗和有效的治療性藥物。本毒株毒力強(qiáng)，可為大熊貓犬瘟熱疫苗研制和高免血清的制備提供材料。

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cing results;Sbjct.

equence(KP738610.1)

Identification of Canine Distemper Virus LG Strain Isolated from Giant Panda

YUE Jin-hua, LIU He-yuan, ZHOU Ming, GAO Yang, YANG Qi-ming, LI Wen-li, CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To isolate a wild strain of canine distemper virus (CDV),after 3 times repeated grinding and freezing,the supernatants of tissue samples of giant panda including heart,lung and liver were inoculated in monolayer Vero cells,and harvested when viruses cause apperently cytopathic effect (CPE).The isolate was identified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) TCID50of CDV was calculated by the Reed-Muench algorithm.The virulence of this isolate was assessed by animal regression assay.The result showed that the CPE such as shrink and pyknosis were observed in Vero cells after blindly passaging 5 times.The length of PCR amplification fragment was 287 bp,which coincided with the expected result.The nucleotide homology between the isolate and CDV SD (14) 11 strain (Asia-Ⅰ) was 98%. The result of TCID50was 10-5.2TCID50/mL.The clinical symptoms of CD like body temperature increasing,nose appearing dry,diarrhea,watery discharge secreted in eyes and nose and so on were observed after inoculation with this isolate.A CDV,named LG strain,was successfully obtained in this study from giant panda.

CDV;giant panda;isolation and identification

2016-02-28

橫向合作項(xiàng)目(K403021305)

岳進(jìn)華( 1988-)，男，四川安岳人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)10-0060-04