王　紅，曹　志，韓乃君，郭偉偉，范根成

(青島易邦生物工程有限公司/動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266114)

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禽腦脊髓炎病毒VR株的致病性研究

王紅，曹志，韓乃君，郭偉偉，范根成*

(青島易邦生物工程有限公司/動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266114)

為探索禽腦脊髓炎病毒強(qiáng)毒VR株對(duì)SPF雞的致病性，開展了不同接種途徑和不同日齡SPF雞的致病力試驗(yàn)。不同接種途徑致病力試驗(yàn)結(jié)果表明，AEV VR株口服后不能引起發(fā)??；刺種、肌肉注射途徑接種隨著日齡增大，發(fā)病率降低；腦內(nèi)注射途徑接種可引起試驗(yàn)雞全部發(fā)病。最小致病量試驗(yàn)結(jié)果顯示，VR株腦內(nèi)注射攻毒的最小致病量為102.0EID50。不同日齡SPF雞的致病力試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著試驗(yàn)雞日齡的增大，其致病力略有差異，日齡越小，發(fā)病率越高。結(jié)果表明，AEV VR株腦內(nèi)攻毒70日齡內(nèi)SPF雞的發(fā)病率為80%及以上，攻毒劑量為104.0EID50。

禽腦脊髓炎病毒VR株；接種途徑；日齡；最小致病量；致病性

禽腦脊髓炎(Avian encephalomyelitis,AE)又稱流行性震顫，是由禽腦脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)引起的一種病毒性傳染病，主要危害4周齡以下雛雞，以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起非化膿性腦炎為主要病理學(xué)特征[1-3]。臨床表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)失調(diào)、頭頸震顫和后趾麻痹等神經(jīng)癥狀[1]。雛雞最易感染，發(fā)病率一般為20%～60%，病死率10%～25%，甚至更高[3]。成年雞感染可引起一過(guò)性產(chǎn)蛋下降(5%～10%)，但不表現(xiàn)神經(jīng)癥狀[1]，嚴(yán)重情況下病毒經(jīng)血液進(jìn)入種蛋，使孵化率降低并引起子代雛雞帶毒發(fā)病[4-5]。

該病尚無(wú)有效的藥物治療，預(yù)防主要依靠疫苗免疫接種。美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、西班牙等國(guó)家已于20世紀(jì)60年代，成功研制出了禽腦脊髓炎弱毒活疫苗[6]及禽腦脊髓炎-雞痘二聯(lián)活疫苗[7]，并已商品化生產(chǎn)和銷售。國(guó)際上疫苗的免疫效果均采用對(duì)VR株的攻毒保護(hù)率來(lái)評(píng)估，因此本研究采用不同途徑、不同日齡SPF雞進(jìn)行AEV VR株的致病力研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1禽腦脊髓炎強(qiáng)毒VR株凍干毒種，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2SPF雞胚SPF種蛋,購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，購(gòu)回后自行孵化至所需日齡。

1.1.3SPF雞1日齡SPF雛雞，SPF種蛋購(gòu)回后,在青島易邦生物工程有限公司動(dòng)物房孵化出雛；14日齡～84日齡SPF雞，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1VR株毒種的制備及病毒含量測(cè)定

1.2.1.1VR株毒種的制備將VR株凍干毒種用滅菌PBS復(fù)原后作20倍稀釋，經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃繼續(xù)孵育，至16日齡時(shí)收獲雞胚腦組織，研磨后加滅菌PBS做1∶4稀釋，凍融3次后，4 000 r/min離心30 min后取上清，分裝1.0 mL/支，置-70℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.2.1.2VR株毒種病毒含量測(cè)定將VR株毒種用滅菌PBS作10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個(gè)稀釋度，分別經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚各5枚，0.2 mL/枚，另取5枚同批次SPF雞胚作對(duì)照。37 ℃孵育(48 h內(nèi)死亡者棄去不計(jì))至16日齡后，剖檢觀察其病變，統(tǒng)計(jì)各稀釋度接種感染胚數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算EID50[8]。

1.2.2對(duì)SPF雛雞不同接種途徑的致病性試驗(yàn)用AEV VR株強(qiáng)毒經(jīng)口服、刺種、肌肉注射、腦內(nèi)注射4種途徑，分別接種1日齡、21日齡SPF雛雞各10只，104.0EID50/只；另設(shè)1日齡、21日齡SPF雛雞各10只不接種作為對(duì)照，分別于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)28 d，觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況。

1.2.3最小致病量試驗(yàn)將AEV VR株強(qiáng)毒稀釋成每0.1 mL分別含104.0EID50、103.0EID50、102.0EID50、5×101.0EID50，分別腦內(nèi)注射攻毒42日齡SPF雞各10只，0.1 mL/只；另設(shè)同日齡SPF雞腦內(nèi)注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照，0.1 mL/只。分別于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)28 d，觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況。

1.2.4對(duì)不同日齡SPF雞的致病性試驗(yàn)用AEV VR株強(qiáng)毒，分別腦內(nèi)注射14、42、56、70、84日齡SPF雞各10只，104.0EID50/只；另設(shè)14、84日齡SPF雞各10只不接種作為對(duì)照。分別于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)28 d，觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況。

2　結(jié)果

2.1VR株毒種制備及病毒含量測(cè)定結(jié)果

將VR株毒種經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，接種后第10日收毒。收獲時(shí)雞胚可見典型病變：胚體小，發(fā)育不良，皮膚干燥，被毛粗亂，腿細(xì)爪曲或外翻，腦有出血點(diǎn)、水腫、腦脊髓軟化等。毒種的病毒含量為105.7EID50/0.2 mL。

2.2對(duì)SPF雛雞不同接種途徑的致病性試驗(yàn)結(jié)果

用AEV VR株病毒(104.0EID50)經(jīng)4種途徑分別接種1日齡和21日齡SPF雛雞，觀察28 d。結(jié)果顯示，AEV VR株口服試驗(yàn)雞均未見異常；刺種和肌肉注射1日齡SPF雛雞均100%發(fā)病，21日齡SPF雛雞均未見異常；腦內(nèi)注射試驗(yàn)雞均100%發(fā)病。對(duì)照組雞均正常。發(fā)病雞臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁，羽毛蓬松，反應(yīng)遲鈍，閉眼，縮頸，低頭或扭頭，喜臥，驅(qū)趕時(shí)共濟(jì)失調(diào)，站立困難，斜坐在跗部，癱瘓，偶爾見頭頸部震顫等(表1)。

表1　對(duì)SPF雛雞不同接種途徑的致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Pathogenic test in SPF chickens by different routes of vaccination

2.3最小致病量試驗(yàn)結(jié)果

用不同劑量AEV VR株病毒分別腦內(nèi)注射攻毒42日齡SPF雞，觀察28 d。結(jié)果顯示，104.0EID50攻擊10/10發(fā)病，103.0EID50攻擊9/10發(fā)病，102.0EID50攻擊8/10發(fā)病，5×101.0EID50攻擊5/10發(fā)病。PBS對(duì)照雞10/10正常。發(fā)病雞臨床主要表現(xiàn)同2.2(表2)。

表2　最小致病量試驗(yàn)結(jié)果Table 2　The minimum amount of pathogenic test

2.4對(duì)不同日齡SPF雞的致病力試驗(yàn)結(jié)果

用AEV VR株病毒(104.0EID50)腦內(nèi)注射不同日齡SPF雞，觀察28 d。結(jié)果顯示，14日齡SPF雞發(fā)病率為10/10；42日齡～70日齡SPF雞發(fā)病率為8/10～9/10；84日齡SPF雞發(fā)病率為7/10。對(duì)照雞均10/10正常。發(fā)病雞臨床主要表現(xiàn)同2.2(表3)。

表3　對(duì)不同日齡SPF雞的致病力試驗(yàn)結(jié)果Table 3　Pathogenic test with different ages of SPF chickens

3　討論

本試驗(yàn)采用AEV VR株(104.0EID50)經(jīng)4種途徑分別接種1日齡和21日齡SPF雛雞。結(jié)果顯示，只有腦內(nèi)注射1日齡、21日齡SPF雛雞均10/10發(fā)??；刺種、肌肉注射對(duì)1日齡SPF雛雞能引起10/10發(fā)病，但對(duì)21日齡SPF雛雞不能引起發(fā)??；口服均不能引起發(fā)病。比較得出腦內(nèi)注射途徑最易感，所以AEV VR株攻毒途徑采用腦內(nèi)注射。本試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了關(guān)于AEV VR株的描述：AEV VR株病毒是通過(guò)雞腦內(nèi)接種反復(fù)傳代而獲得的雞胚適應(yīng)株，這類病毒高度嗜神經(jīng)。腦內(nèi)接種(發(fā)病率穩(wěn)定)或非腸道途徑，如肌肉或皮下接種(發(fā)病率不穩(wěn)定)均可引起嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。除非劑量很高，口服一般不引起感染，也不能水平傳播[1]。

試驗(yàn)采用不同劑量AEV VR株，分別腦內(nèi)注射攻毒42日齡SPF雞。結(jié)果顯示，102.0EID50的AEV VR株攻毒能達(dá)到80%的臨床發(fā)病率，因此，AEV VR株的最小致病量定為102.0EID50。Westbury H A等[9]報(bào)道稱，1日齡～42日齡雞(AE抗體陰性)，VR株腦內(nèi)注射(約含102.0EID50)攻毒臨床發(fā)病情況為：1日齡～28日齡雞攻毒發(fā)病率為5/5，35日齡～42日齡雞攻毒發(fā)病率為4/5。考慮到實(shí)際應(yīng)用中環(huán)境溫度、稀釋液、操作等各種因素對(duì)病毒的影響，為保證攻毒結(jié)果成立，攻毒劑量定為104.0EID50。

AEV VR株(104.0EID50)腦內(nèi)注射對(duì)不同日齡SPF雞的致病力隨著日齡增大略有下降。日齡越小，發(fā)病率越高，臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重。Westbury H A等的研究表明[10]，35日齡～56日齡試驗(yàn)雞(沒有感染過(guò)AEV)，VR株(約含104.0EID50)腦內(nèi)注射攻毒臨床發(fā)病情況為：35日齡雞攻毒發(fā)病率為5/5，42日齡～49日齡雞攻毒發(fā)病率為4/5，56日齡雞攻毒發(fā)病率為3/5。因此，本試驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外的研究結(jié)果基本一致。

關(guān)于試驗(yàn)雞臨床發(fā)病判定應(yīng)該注意：試驗(yàn)雞腦內(nèi)注射AEV VR株攻毒潛伏期一般5 d～10 d，觀察其臨床發(fā)病表現(xiàn)差別很大。較嚴(yán)重者臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、站立困難、斜坐在跗部甚至癱瘓，偶爾可見頭頸部震顫，癥狀比較明顯，因此容易判定；較輕者臨床表現(xiàn)為低頭或扭頭、縮脖、喜臥、閉眼、羽毛蓬松、精神沉郁、反應(yīng)遲鈍等，癥狀不明顯，因此不容易判定。所以試驗(yàn)雞在每日觀察時(shí)，要與對(duì)照雞進(jìn)行對(duì)比觀察，尤其是精神狀態(tài)和對(duì)外界的反應(yīng)情況，要仔細(xì)對(duì)比觀察并認(rèn)真記錄，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率才能準(zhǔn)確。

[1]Saif Y M.禽病學(xué)[M].12版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012：497-500.

[2]王純潔，馬學(xué)恩，趙振華.禽腦脊髓炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2003，24(2)：45-48.

[3]張淑霞，楊增岐，季芳，等.禽腦脊髓炎病毒感染雛雞的病理組織學(xué)觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45(11)：26-28.

[4]張淑霞，楊增歧，李金鈞，等.禽腦脊髓炎的調(diào)查及病毒分離[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，20(6)：551-553.

[5]Calnek B W.Control of avian encephalomyelitis：A historical account[J].Avian Dis,1998,42：632-647.

[6]Calnek B W,Taylor PJ,Sevoian M.Studies on avian encephalomye-litis.Development and application of an oral vaccine[J].Avian Dis，1961，5：297-312.

[7]秦卓明，何葉峰，劉偉，等.禽腦脊髓炎的研究進(jìn)展和控制對(duì)策[J].中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊：禽病防治，2002，19(1)：18-20.

[8]李凱善.禽腦脊髓炎病毒YBF02毒株的毒力測(cè)定與種子批建立[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[9]Westbury H A，Sinkovic B.The pathogenesis of infectious avian encephalomyelitis，IV.The effect of maternal antibody on the development of the disease[J].Aust Vet J，1978，54：81-85.

[10]Westbury H A，Sinkovic B.The pathogenesis of infectious avian encephalomyelitis，I.The effect of the age of the chicken and the route of administration of the virus[J].Aust Vet J 1978，54：68-71.

Study on Pathogenicity of Avian Encephalomyelitis Virus Van Roekel Strain

WANG Hong，CAO Zhi，HAN Nai-jun，GUO Wei-wei，F(xiàn)AN Gen-cheng

(YebioBioengineeringCo.,Ltd.,StateKeyLaboratoryofAnimalGeneticEngineeringVaccine,Qingdao,Shandong,266114,China)

To study the pathogenicity of avian encephalomyelitis virus Van Roekel (VR) strain in SPF chickens,pathogenicity test was conducted with SPF chickens of various ages by different routes of vaccination.Pathogenicity test in SPF chickens by different routes of administration showed that chickens had no clinical signs after oral route vaccination, and with the growth of the chickens,the incidence rate decreased by wing-web and intramuscular inoculation,however,intracerebral injection led to 100% mortality.The minimum pathogenic dose was 102.0EID50by intracerebral route in the study of minimum amount of pathogenic test.The pathogenicity test with SPF chickens of various ages indicated that the younger the chicken is, the higher the morbidity is.Moreover,all the above serve to prove that the incidence rate of 80% or over 80% was achieved by challenging with virulent AEV VR strain to SPF chickens less than 70 day-old by intracerebral route of inoculation, with the challenge dose of 104.0EID50.

Avian encephalomyelitis virus Van Roekel stain; route of administration;day age;minimum pathogenic dose;pathogenicity

2016-03-11

王紅(1977-)，女，山東鄒平人，獸醫(yī)師，學(xué)士，主要從事禽用疫苗研究和檢驗(yàn)工作。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2016)10-0057-03