杜潤慈，冉多良，李　靜，付　強，劉建華

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

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馬鏈球菌對樹突狀細胞Toll樣受體和MyD88及細胞因子mRNA表達的影響

杜潤慈，冉多良，李靜，付強，劉建華*

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

為探究馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubsp.equi,S.equi)對小鼠骨髓源樹突狀細胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)TLR1、TLR2、TLR6、MyD88、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α mRNA表達的影響，用GM-CSF、IL-4細胞因子刺激小鼠骨髓細胞使其誘導分化成未成熟的BMDCs，感染S.equi后16、20、26 h，采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測感染組及未感染組細胞TLRs、MyD88和細胞因子mRNA的表達情況。結(jié)果顯示，S.equi感染BMDCs后16、20、26 h，TLR1、TLR2、TLR6、MyD88 mRNA的表達量均顯著或極顯著的高于未感染組(P<0.05或P<0.01)。S.equi感染DCs后16、26 h，IL-1的分泌量較未感染組沒有變化(P>0.05)，IL-10、TNF-α的分泌量顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)。IL-6在S.equi感染DCs后16 h的分泌量顯著增加(P<0.05)，但感染后26 h無顯著變化(P>0.05)。IL-12在S.equi感染DCs后16 h的表達沒有變化(P>0.05)，但感染后26 h分泌量有所增加(P<0.05)。說明S.equi具有調(diào)節(jié)DCs TLRs、MyD88和細胞因子表達的能力，從而介導機體的免疫應答反應。

馬鏈球菌馬亞種；樹突狀細胞；Toll樣受體；細胞因子

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種古老而又保守的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，被科學界稱為機體最主要的病原體“傳感器”。果蠅Toll蛋白的發(fā)現(xiàn)導致TLRs在生物免疫學領域快速發(fā)展[1]。目前，在人類共發(fā)現(xiàn)10種TLRs家族成員，在老鼠共發(fā)現(xiàn)12種TLRs。TLR1、2、4、5、6主要表達于細胞表面并能識別來自細菌、真菌和原生動物的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，TLR3、7、8、9則表達于細胞內(nèi)，主要識別病毒和細菌的核酸[2-3]。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是另一個在宿主抵御病原微生物方面的“哨兵”[4]，PAMPs或炎性細胞因子可促進DCs成熟，增強其抗原遞呈功能，將病原體從外周組織遞呈到引流淋巴結(jié)，通過T淋巴細胞誘導獲得性免疫應答，因此DCs是聯(lián)接自然性免疫應答與獲得性免疫應答的橋梁[5]。近年來，多個研究表明鏈球菌感染宿主與TLRs有關[6-7]，但關于馬鏈球菌與TLRs關聯(lián)的報道較少。本試驗以馬腺疫病原菌馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubsp.equi,S.equi)作為研究對象，GM-CSF、IL-4誘導小鼠骨髓細胞獲得小鼠骨髓源樹突狀細胞(bone marrow derived dendritic cells，BMDCs),應用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術，檢測S.equi感染BMDCs后不同時間細胞TLR1、TLR2、TLR6、MyD88、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α mRNA的表達水平，探討這些基因與S.equi感染BMDCs之間的關系，為了解馬腺疫的致病機制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及實驗動物S.equi新疆株，新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院傳染病實驗室保存；C57BL/6純系雄性小鼠，6周齡～8周齡，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2主要儀器倒置光學顯微鏡，日本尼康公司產(chǎn)品；恒溫細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；低溫臺式離心機，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；ABI7300 Real-time PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；流式細胞儀及分析軟件，美國Beckman公司產(chǎn)品。

1.1.3主要試劑 重組小鼠GM-CSF、IL-4細胞因子,美國Pepretech公司產(chǎn)品；FITC anti-mouse CD11c流式抗體及同型對照、PE anti-mouse I-A/I-E(MHCⅡ)流式抗體及同型對照、PE anti-mouse CD80流式抗體及同型對照、PE anti-mouse CD86流式抗體及同型對照，美國Biolegend公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibco公司產(chǎn)品；Trizol和cDNA第一條鏈合成試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；pMD19-T載體，寶生物工程 (大連) 有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；Trans Start Tip Green qPCR Super Mix試劑盒，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1分離誘導培養(yǎng)BMDCs將C57BL/6小鼠處死后，浸入750 mL/L乙醇中消毒5 min～10 min，無菌狀態(tài)下取出脛骨和股骨，剪去骨一端，用注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液刺入骨髓腔反復沖洗，收集骨髓細胞至無菌培養(yǎng)皿中，吹散細胞后,1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入3倍體積的Tris-NH4Cl紅細胞裂解液溶解紅細胞5 min，RPIM-1640培養(yǎng)液中和后再次離心，棄上清。用含100 mL/L胎牛血清、20 ng/mL GM-CSF、10 ng/mL IL-4 的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板(1×106/孔)，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后除去未貼壁細胞并補足培養(yǎng)液，隔日半量換液。培養(yǎng)至第7天時，輕輕吹打培養(yǎng)板，收獲半懸浮細胞，即BMDCs。

1.2.2流式細胞術分析細胞免疫表型 收集第7天的BMDCs，PBS洗滌1遍后，將細胞計數(shù)為每管1×106個/100 μL，分別加入相應的FITC-CD11c、PE-D80、PE-CD86和PE-MHCⅡ流式抗體，使其終濃度分別達到2.5、5、10、2.5 μg/mL，4 ℃避光孵育20 min。PBS洗滌2遍～3遍，去除未結(jié)合的抗體。取細胞懸液于流式細胞儀進行細胞表型分析。

1.2.3S.equi感染BMDCs將BMDCs培養(yǎng)在6孔細胞培養(yǎng)板中(1×106個/孔)，用S.equi以感染復數(shù)20∶1的比例分別感染細胞16、20、26 h，設置未感染對照組，每組3個重復孔。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測S.equi感染BMDCs后TLRs、MyD88和細胞因子的表達 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR中，TLRs、MyD88和細胞因子引物的設計和合成、β-actin和目的基因陽性質(zhì)粒的構建、熔解曲線和標準曲線的建立、細胞總RNA提取和制備cDNA的方法均按照新疆農(nóng)業(yè)大學傳染病實驗室已經(jīng)建立的實時熒光定量PCR檢測方法進行[8]。每個試驗樣品進行3次重復。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 采用2-△△Ct方法處理數(shù)據(jù)，用SPSS19.0對TLR1、TLR2、TLR6 、MyD88、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α在感染組和未感染組的表達量進行t檢驗顯著性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠骨髓來源樹突狀細胞的鑒定

小鼠骨髓細胞經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導培養(yǎng)至第7天時，大部分細胞呈半懸浮集落狀，吹散后單個細胞表面有明顯樹枝樣突起，為典型的樹突狀細胞形態(tài)(圖1)。采用流式細胞術雙標法對細胞表型進行檢測，即以樹突狀細胞表面特異性分子CD11c設門，在CD11c陽性細胞中檢測CD80、CD86、MHCⅡ陽性的比例。結(jié)果顯示，CD11c和CD80、CD86、MHCⅡ雙陽性率分別為52.4 %、49.4 %和29.7 %，為典型的BMDCs表型特性(圖2)。

2.2S.equi對BMDCs TLR1、TLR2、TLR6和MyD88 mRNA表達的影響

以β-actin為內(nèi)參基因，采用 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術分別檢測S.equi感染小鼠BMDCs后16、20、26 h組及未感染組TLR1、TLR2、TLR6和MyD88 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(圖3)。TLR1在S.equi感染小鼠BMDCs后16、20、26 h的表達量高于未感染組，并且感染后16、20 h的表達極顯著高于對照組(P<0.01)，感染后26 h的表達顯著高于未感染組(P<0.05)。TLR2在S.equi感染小鼠BMDCs后16、20 、26 h的表達量顯著高于未感染組(P<0.05)，TLR6的表達極顯著高于未感染組(P<0.01)。MyD88在S.equi感染小鼠BMDCs后16、20、26 h的表達量高于未感染組，并且在感染后20 h的表達極顯著高于未感染組(P<0.01)，感染后16、26 h的表達顯著高于未感染組(P<0.05)。

圖1　BMDCs的形態(tài)學特征

圖2　流式細胞術分析樹突狀細胞表型

**表示與0 h相比差異極顯著(P<0.01)，*表示與0 h相比差異顯著(P<0.05)

**indicates extremely significant difference compared with 0 h(P<0.01),*indicates significant difference compared with 0 h(P<0.05)

圖3S.equi感染BMDCs不同時間后TLRs和MyD88 mRNA相對表達量

Fig.3Relative expression levels of TLRs and MyD88 mRNA in BMDCs at different time intervals afterS.equiinfection

2.3S.equi對BMDCs IL-1、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α mRNA表達的影響

采用 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR分別檢測S.equi感染小鼠BMDCs后16、26 h組及未感染組IL-1、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果見圖4，IL-1在S.equi感染小鼠BMDCs后16、26 h的表達量較未感染組沒有變化(P>0.05)。IL-6在S.equi感染小鼠BMDCs后16 h的表達顯著高于未感染組(P<0.05)，感染后26 h的表達較未感染組沒有變化(P>0.05)。IL-10在S.equi感染小鼠BMDCs后16、26 h的表達極顯著高于未感染組(P<0.01)。IL-12在S.equi感染小鼠BMDCs 后16 h的表達較未感染組沒有變化(P>0.05)，但感染后26 h的表達顯著高于未感染組(P<0.05)。TNF-α在S.equi感染小鼠BMDCs后16、26 h的表達量高于未感染組，感染后16 h的表達顯著高于未感染組(P<0.05)，感染后26 h的表達極顯著高于未感染組(P<0.01)。

**表示與0 h相比差異極顯著(P<0.01)，*表示與0 h相比差異顯著(P<0.05)

**indicates extremely significant difference compared with 0 h(P<0.01),*indicates significant difference compared with 0 h(P<0.05)

圖4S.equi感染BMDCs不同時間后細胞因子 mRNA相對表達量

Fig.4Relative expression levels of cytokines mRNA in BMDCs at different time intervals afterS.equiinfection

3　討論

高等動物的免疫防御機制主要由天然免疫和獲得性免疫兩個部分組成。天然性免疫系統(tǒng)可以快速識別病原體，并以非特異性的方式抵御外來感染；獲得性免疫系統(tǒng)則以體液免疫或細胞免疫的方式來清除病原微生物。TLRs作為一種最具代表性的PRRs在識別病原微生物的過程中起著至關重要的作用。TLRs胞外區(qū)富含多個重復的亮氨酸序列，可識別病原體的PAMPs，經(jīng)過跨膜區(qū)后將信號傳遞給胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)存在一段與IL-1受體胞內(nèi)區(qū)高度同源的序列，被稱為Toll/IL-1(TIR)區(qū)域，該區(qū)域可與下游同樣具有TIR結(jié)構域的MyD88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)相互作用，激活NF-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)或者AP-1(activator protein-1，AP-1)，誘導細胞因子的分泌[9]。因此，了解S.equi是否介導TLRs途徑傳遞信號對探明S.equi的感染機制有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，S.equi感染小鼠BMDCs后8、32 h時，TLR1、2、6、MyD88的表達量沒有變化(此部分數(shù)據(jù)未表示出來)，但感染后16、20、26 h，TLR1、TLR2、TLR6和MyD88的表達量較未感染組均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，說明DCs的TLRs可以識別S.equi的PAMPs，導致接頭蛋白MyD88的激活，調(diào)控下游信號的轉(zhuǎn)導，這與許多其他鏈球菌的試驗結(jié)果是一致的[10-11]。

TLRs不僅在天然免疫中發(fā)揮作用，而且還在調(diào)節(jié)獲得性免疫中扮演重要的角色[12-13]。DCs是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，當未成熟DCs的TLRs識別特異的PAMPs后，可以通過上調(diào)主要組織相容性抗原復合物(major histocompability complex,MHC)和共刺激分子，促進DCs成熟，分泌不同的細胞因子，激活Th0細胞分化成Th1型、Th2型等各種不同的免疫效應細胞[14]。

IL-1為促炎性細胞因子，在介導機體炎癥反應中起到關鍵作用，可以增強NK細胞和B細胞的活性，并在一定程度上反映細胞的受損情況[15]。IL-6能調(diào)節(jié)多種細胞的生理功能，可以刺激B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白，促進T細胞的增殖與分化[16]。IL-10作為一種抗炎性細胞因子，可以抑制Th1細胞產(chǎn)生干擾素、TNF-α、IL-1等細胞因子，抑制炎癥反應，維持機體免疫平衡，并且在抑制細胞免疫的同時能有效地提高B細胞活性，促進體液免疫[17]。IL-12是一種非常重要的誘導Thl型免疫應答的細胞因子，能夠抵抗細胞內(nèi)部的病原菌[18]。TNF-α是一種具有雙重功能的細胞因子，在調(diào)節(jié)機體免疫和抗感染等方面具有重要作用，但TNF-α的過度表達會導致機體組織壞死[19]。本試驗結(jié)果表明，S.equi感染小鼠BMDCs后16、26 h，IL-10 mRNA水平極顯著高于未感染組，并與時間呈正相關關系。感染期IL-10分泌量升高會抑制樹突狀細胞的活化，產(chǎn)生一定的免疫抑制反應，減緩對細菌的清除，這可能是機體難以清除S.equi的免疫學機制之一。本試驗還觀察到感染S.equi16、26 h后，IL-6、IL-12、TNF-α的分泌量有所增加，暗示在抵抗S.equi感染中，細胞免疫也發(fā)揮了作用，但可能以IL-10介導的體液免疫為主。有研究表明，豬鏈球菌感染樹突狀細胞16 h后，通過TLRs-MyD88途徑大量分泌IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-α，豬鏈球菌誘導促炎性因子的過度表達，引發(fā)了IL-10的上調(diào)來抑制炎性因子的產(chǎn)生，這是細胞的一種自我保護反應[20]。

本研究通過SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)S.equi感染DCs可引起TLR1、TLR2、TLR6、MyD88及細胞因子IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，說明TLRs介導的信號通路參與了S.equi感染DCs的過程，可為研究馬腺疫鏈球菌的致病機制奠定理論基礎。

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Effects ofStreptococcusequion mRNA Expressions of

TLR1,TLR2,TLR6,MyD88 and Cytokines in Dendritic Cells

DU Run-ci, RAN Duo-liang, LI Jing, FU Qiang, LIU Jian-hua

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

To study the effects ofStreptococcusequisubspequi(S.equi) on the mRNA expressions of TLR1,TLR2,TLR6,MyD88,IL-1,IL-6,IL-10,IL-12 and TNF-α in mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) culturedinvitro,Naive DCs were cultured with GM-CSF and IL-4,SYBR Green Ⅰfluorescence quantitative PCR was used to detect mRNA transcriptional levels of TLRs,MyD88 and cytokines after infection withS.equiabout 16,20,26 h.The results showed that at 16,20,26 h post-infections,the expression levels of TLR1,TLR2,TLR6 and MyD88 inS.equiinfected BMDCs were significantly or extremely significantly higher than those of the negative control group (P<0.05 orP<0.01 ).At 16,26 h post-infections,the concentration of IL-1 had no obviously change (P>0.05),IL-10,TNF-α were significantly or extremely significantly increased than those of the negative control group (P<0.05 orP<0.01).IL-6 was significantly increased at 16 h post-infection (P<0.05),however,it had no change at 26 h post-infection (P>0.05).At 16 h post-infection,the concentration of IL-12 had no obviously change (P>0.05),while at 26 h post-infection,it was significantly increased (P<0.05). These results indicated thatS.equiwas able to regulate the mRNA expressions of TLRs,MyD88 and cytokines,which mediated immune responses.

Streptococcusequisubsp.equi;dendritic cell;Toll-like receptor;cytokine

2016-03-04

國家科技支撐計劃項目(2012BAD46B00)

杜潤慈(1991-)，女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事動物傳染病診斷與防治的研究。*通訊作者

S852.611

A

1007-5038(2016)10-0016-05