袁玉梅　樓亞玲

浙江省湖州市中心醫(yī)院藥劑科，浙江湖州313000

羥基紅花黃色素A對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響

袁玉梅樓亞玲

浙江省湖州市中心醫(yī)院藥劑科，浙江湖州313000

目的研究羥基紅花黃色素A（HSYA）對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其作用機制。方法體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，經(jīng)不同濃度（25、100、400 μmol/L）HSYA處理后分別采用四甲基偶氮唑藍(lán)法（MTT）、劃痕試驗和Transwell試驗觀察HSYA對U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，采用Western blot方法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與空白對照組比較，HSYA能降低U251細(xì)胞存活率，縮短細(xì)胞遷移距離，減少U251細(xì)胞穿膜數(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），同時，HSYA能下調(diào)MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)。結(jié)論HSYA對腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等具有抑制作用，其作用機制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)。

羥基紅花黃色素A；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；抑制作用

［Abstract］Objective To investigate the effects of hydroxysafflor yellow A（HSYA）on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells，and to explore its mechanism.Methods The human glioma U251 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of HSYA（25，100，400 μmol/L），then the methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay，scratch test and Transwell assay were used to observe the effects of HSYA on proliferation，migration and invasion of U251 cells respectively，and the expression levels of matrix metalloproteinase（MMP）-2 and MMP-9 were examined by Western blot assay.Results Compared with blank control group，the U251 cell viability in HSYA group was decreased，the migration distance was shortened，the number of penetrated cells was reduced obviously，the differences were all statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Moreover，HSYA could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9.Conclusion HSYA has inhibitory effects for the proliferation，migration and invasion of glioma cells，and the mechanism may be related to the inhibition of MMP-2 and MMP-9 expression.

［Key words］Hydroxysafflor yellow A；Glioma cells；Inhibitory effect

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，具有發(fā)病率、病死率和復(fù)發(fā)率高的特點。對于惡性膠質(zhì)瘤的治療，現(xiàn)階段主要為手術(shù)切除，術(shù)后輔以放療和化療，但由于惡性膠質(zhì)瘤的侵襲性強，術(shù)后容易復(fù)發(fā)，總體治療效果不理想。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中國傳統(tǒng)中藥紅花中含量最高的主要活性成分，具有顯著的藥理活性［1］。近年來多項研究表明HSYA具有抗腫瘤作用［2-4］，本研究觀察HSYA對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等作用，以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等的表達(dá)情況，探討HSYA對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用及機制，為研究高效、低毒的中藥抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）用含10%胎牛血清MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2MTT法測定U251細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，以2×104個/mL密度接種于96孔板，貼壁24 h后，經(jīng)不同濃度HSYA（25、100、400 mmol/L）（中國食品藥品檢定研究院，批號111637-201308）、陽性對照替莫唑胺（100 mmol/L）（Sigma公司）處理72 h，加入MTT液使終濃度為0.5 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)液體，加入100 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解藍(lán)紫色復(fù)合物，震蕩10 min，于酶標(biāo)儀上490 nm波長處測定吸光度值（A490）。細(xì)胞存活率=處理組A490/對照組A490×100%。

1.3劃痕試驗檢測U251細(xì)胞遷移

將對數(shù)生長期的U251細(xì)胞按照5×104個/mL密度接種于96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，用無菌100 mL槍頭于細(xì)胞層中橫向劃線，形成寬度均勻一致的劃痕，造成細(xì)胞傷口模型，在顯微鏡下拍照，測定劃痕寬度。24 h后測定劃痕寬度。使用Image軟件測量劃痕距離，每條劃痕取3個測量點，計算平均寬度值。

1.4Transwell試劑盒檢測U251細(xì)胞的侵襲能力

采用Transwell小室法構(gòu)建侵襲模型，用無血清MEM將U251細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105個/mL，取0.25 mL加入Transwell上室，同時進(jìn)行藥物干預(yù)（HSYA100mmol/L，陽性對照組替莫唑胺100 mmol/L），下室中加入0.5 mL含有10%胎牛血清的MEM。置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后取出小室并棄去小室內(nèi)液體，將小室置入0.1%結(jié)晶紫染色液中染色20 min，純凈水清洗后以棉簽拭去小室濾膜上表面的細(xì)胞，干燥后使用200 μL醋酸脫色液脫色15 min，取100 μL至96孔板檢測560 nm的OD值。

1.5Western blot檢測MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)

U251細(xì)胞經(jīng)HSYA處理后，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白質(zhì)行10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人MMP-2、MMP-9單抗（Cell signaling公司，1∶1000）4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（上?？党晒荆┓跤? h，最終用X線膠片曝光分析。內(nèi)參對照使用β-actin（上?？党晒荆?/p>

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用One way-ANOVA，組間比較采用Tukey法進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HSYA對U251細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同濃度的HSYA（100、400 mmol/L）能顯著性降低U251細(xì)胞的存活率［分別為正常對照的（87.7±3.7）%與（77.0±3.7）%］，抑制U251細(xì)胞的增殖，并具有濃度依賴性。與陽性對照組替莫唑胺比較，高濃度的HSYA（400 mmol/L）對U251細(xì)胞有較強的抑制增殖作用，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1　HSYA對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響

2.2HSYA對U251細(xì)胞遷移的影響

采用體外劃痕法觀察HSYA對U251細(xì)胞遷移能力的影響，劃痕的寬度由于細(xì)胞的遷移變小，并逐漸融合。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，HSYA組細(xì)胞遷移距離減小，中、高濃度的HSYA組（100、400 mmol/L）U251細(xì)胞遷移距離分別為空白對照組的（88.8± 9.5）%與（75.4±17.5）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2），表明HSYA能抑制U251細(xì)胞的遷移。

圖2　HSYA對U251細(xì)胞遷移能力的影響（400×）

2.3HSYA對U251細(xì)胞侵襲的影響

Transwell小室法檢測結(jié)果（圖3）顯示，HSYA（100 mmol/L）組與陽性對照替莫唑胺組（100 mmol/L）相似，560 nm OD值較對照組明顯下降，提示穿過Transwell小室濾膜的U251細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖3），表明HSYA能降低U251細(xì)胞的侵襲能力。

2.4HSYA對U251細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，經(jīng)HSYA干預(yù)處理的U251細(xì)胞MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)水平下調(diào)（圖4），與陽性對照替莫唑胺結(jié)果類似，提示HSYA對U251細(xì)胞的抑制作用可能與MMP-2、MMP-9兩種侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān)。

圖3　HSYA對U251細(xì)胞侵襲能力的影響（200×）

圖4　HSYA對U251細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3　討論

紅花黃色素是中藥紅花發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，而HSYA是其中含量最高的活性成分，目前臨床上主要因為其抗血小板聚集、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用而廣泛用于心腦血管疾病［5-7］。近年來較多研究表明紅花黃色素具有抑制腫瘤作用，如胃癌［2，8］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、肺癌［9］等。

但相關(guān)研究中，大部分多集中在HSYA對腫瘤新生血管生成的抑制研究上，如有研究結(jié)果表明，HSYA能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移等抑制腫瘤血管生成［10-13］。而對于HSYA在腫瘤細(xì)胞本身上的抑制作用研究較少，本研究在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中明確了HSYA的腫瘤抑制作用。結(jié)果表明，一定濃度的HSYA能顯著性抑制U251細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈濃度依賴性，與陽性對照替莫唑胺比較，HSYA對U251細(xì)胞的抑制作用不弱于替莫唑胺。

膠質(zhì)瘤的高侵襲性是膠質(zhì)瘤患者高復(fù)發(fā)的重要原因，而細(xì)胞的遷移及侵襲能力是影響細(xì)胞侵襲性的關(guān)鍵因素［14］。有研究表明某些中成藥能通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲從而發(fā)揮抗腫瘤作用［15］。本研究通過劃痕試驗及Transwell侵襲試驗提示，HSYA能有效抑制U251細(xì)胞的遷移與侵襲，隨著濃度的增加，HSYA抑制U251細(xì)胞遷移的作用增強。

MMPs是一類降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的鋅離子依賴蛋白酶，MMP-2和MMP-9為MMPs中的明膠酶，能降解血管周圍基膜主要成分Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白，利于腫瘤細(xì)胞沿基底膜侵入周圍組織［16-17］。研究表明［18-19］，膠質(zhì)瘤的高侵襲性與MMP-2及MMP-9的表達(dá)活性相關(guān)。近期有研究［20］顯示，MMP-9與膠質(zhì)瘤的分級相關(guān)，低表達(dá)的MMP-9在患者中具有更好的生存結(jié)果，同時對于膠質(zhì)瘤化療經(jīng)典用藥替莫唑胺具有更好的敏感性。因此，MMPs在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)對膠質(zhì)瘤的侵襲以及化療藥物的反應(yīng)性起重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSYA能顯著性下調(diào)U251細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，表明HSYA對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的抑制作用可能與下調(diào)MMP-2和MMP-9兩種侵襲性相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。而奚勝艷等［21］研究也發(fā)現(xiàn)HSYA能下調(diào)胃癌組織中MMP-9的表達(dá)。

綜上所述，HSYA作為一種中藥單體成分，對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲均具有抑制作用，其抑制作用的機制可能與HSYA下調(diào)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)論為進(jìn)一步深入探討HSYA對膠質(zhì)瘤抑制作用的機制及為臨床上探尋HSYA用于膠質(zhì)瘤的治療靶點提供實驗依據(jù)，為尋找高效低毒的抗腫瘤中藥成分提供新思路。

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Effects of hydroxysafflor yellow A on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells

YUAN Yumei LOU Yaling
Department of Pharmacy，Huzhou Central Hospital，Zhejiang Province，Huzhou313000，China

R739.41

A

1673-7210（2016）09（c）-0015-04

2016-06-03本文編輯：張瑜杰）

浙江省湖州市自然科學(xué)資金項目（2013YZ11）。

袁玉梅（1983-），女，碩士；研究方向：神經(jīng)藥理。