孔海芳，岳娜，劉剛，李妍淳，田彬，胡志東△

全血γ干擾素釋放試驗(yàn)診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用價(jià)值

孔海芳1，岳娜1，劉剛2，李妍淳1，田彬1，胡志東1△

目的評價(jià)全血γ干擾素（IFN-γ）釋放試驗(yàn)（QFT-GIT）診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年10月—2015年10月109例（確診病例45例，臨床診斷病例64例）結(jié)核病患者（結(jié)核組）和70例非結(jié)核呼吸系統(tǒng)疾病患者（非結(jié)核組）資料，同時(shí)采用QFT-GIT、膠體金抗結(jié)核抗體（TB-Ab）進(jìn)行檢測，繪制IFN-γ釋放量受試者工作者特征（ROC）曲線，比較2種方法的診斷價(jià)值及QFT-GIT試驗(yàn)在2組中的差異。結(jié)果QFT-GIT對結(jié)核病的診斷敏感度為93.58%，特異度為85.71%，其診斷陽性率高于TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）。2種方法聯(lián)合檢測的敏感度降至52.29%（57/109），但特異度增加至90.00%（63/70）。結(jié)核組IFN-γ釋放量明顯高于非結(jié)核組（U=330，P＜0.05），IFN-γ釋放量ROC曲線下面積為0.913（95%CI：0.864～0.963）。結(jié)論QFT-GIT試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中具有較高的敏感度和特異度，與TB-Ab聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷的特異度，為臨床結(jié)核病的診斷提供及時(shí)有效的依據(jù)。

結(jié)核；卡介苗；診斷試驗(yàn)，常規(guī)；敏感性與特異性；ROC曲線；γ干擾素釋放試驗(yàn)；結(jié)核抗體

結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，其造成的死亡人數(shù)僅次于艾滋病，被列為我國重要傳染病之一［1］。2013年全球估計(jì)有900萬結(jié)核病的新發(fā)病例，有150萬患者死于結(jié)核?。?］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)為130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，成為全球結(jié)核病第二大國［3］。2010年全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，活動性肺結(jié)核患病率為0.5%，約有600萬活動性肺結(jié)核患者［4］。迄今為止，臨床上用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷方法仍存在很多不足，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間長，核酸檢測技術(shù)要求高，結(jié)核菌素試驗(yàn)（Tuberculin skin testing，TST）易受卡介苗（BCG）的干擾。因此，開發(fā)新的快速診斷技術(shù)迫在眉睫。

全血可溶性γ干擾素（IFN-γ）釋放試驗(yàn)（QuantiFERON TB Gold In-Tube，QFT-GIT）具有操作簡便、檢測自動化等優(yōu)點(diǎn)。本文通過比較QFTGIT試驗(yàn)在結(jié)核與非結(jié)核患者中結(jié)果的差異，探討QFT-GIT試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　對象與方法

1.1研究對象收集天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年10月—2015年10月住院患者中篩查出的109例結(jié)核患者（確診病例45例，臨床診斷病例64例）作為結(jié)核組，男53例，女56例，年齡11～99歲，中位年齡60（45，71）歲。參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288—2008）》，結(jié)核分類標(biāo)準(zhǔn)參照《臨床診療指南（結(jié)核病分冊）》，包括呼吸系統(tǒng)結(jié)核病74例和肺外結(jié)核病35例（骨結(jié)核、頸淋巴結(jié)結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腹膜炎、支氣管結(jié)核、泌尿系統(tǒng)結(jié)核以及盆腔結(jié)核等）。31例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，21例痰涂片抗酸染色陽性，18例病理學(xué)診斷陽性。收集同期住院患者中支氣管肺炎、大葉性肺炎、支氣管擴(kuò)張以及慢性支氣管炎患者70例作為非結(jié)核組，男43例，女27例，年齡2～90歲，中位年齡59（36，80）歲。均根據(jù)臨床癥狀、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)表現(xiàn)以及治療效果等證實(shí)，無結(jié)核病史和結(jié)核接觸史。所有入選患者人類免疫缺陷病毒（HIV）篩查陰性、無急性病毒感染、無免疫抑制劑的應(yīng)用以及妊娠。

1.2主要試劑和儀器結(jié)核分枝桿菌抗體（IgG）檢測試劑盒（MP Biomedicals Asia Pacific）；QFT-GIT試劑盒、Sunrise酶標(biāo)儀（澳大利亞Cellestis Limited公司）。離心機(jī)、振蕩器，37℃恒溫孵育箱及洗板機(jī)等，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3研究方法

1.3.1膠體金抗結(jié)核抗體（TB-Ab）檢測采集患者肘正中靜脈血3 mL于促凝管中，離心取上清25 μL至加樣孔，待樣本達(dá)到指示線時(shí)加3滴緩沖液，拉出標(biāo)簽，再加1滴緩沖液，15 min后觀察結(jié)果。

1.3.2QFT-GIT試驗(yàn)在試驗(yàn)當(dāng)天清晨采集患者肘正中靜脈血3～4 mL于肝素鋰抗凝管中，2 h內(nèi)將混勻的全血分裝至TB特異性抗原測試管、絲裂原陽性對照管以及空白對照管中（1 mL/管）?；靹蚝?7℃恒溫孵育16～24 h，4 000 r/min離心15 min，取上清行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測IFN-γ，采用Sunrise酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。QFT-GIT試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：TB抗原測試管-空白對照管≥0.35 IU/mL，且≥25%空白對照管值，判斷為陽性；陽性對照管-空白對照管≥0.50IU/mL，且TB抗原測試管-空白對照管＜0.35 IU/mL，判斷為陰性；陽性對照管-空白對照管＜0.50 IU/mL，且TB抗原測試管-空白對照管＜0.35 IU/mL或空白對照管＞8.00 IU/mL，為不確定結(jié)果。結(jié)果計(jì)算和判定采用澳大利亞Cellestis Limited公司提供的A-QFT軟件（版本2.62）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪圖采用軟件GraphPad prism 5.0。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，組間以及組內(nèi)IFN-γ釋放量比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用診斷性試驗(yàn)比較2種方法的診斷價(jià)值，并繪制受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1QFT-GIT和TB-Ab試驗(yàn)在結(jié)核病診斷特性中的比較2種方法的檢測結(jié)果見表1。QFT-GIT的診斷陽性率高于TB-Ab（2種方法診斷共同陽性64例，共同陰性62例，χ2=43.68，P＜0.01）。2種方法的診斷效能見表2。兩者聯(lián)合診斷時(shí)（串聯(lián)）的敏感度降至52.29%（57/109），而特異度增加至90.00%（63/70）。

Tab.1The results of QFT-GIT and TB-Ab in two groups of patients表1　2組患者QFT-GIT與TB-Ab檢測結(jié)果（例）

2.22組IFN-γ釋放量比較排除假陽性和假陰性，陽性對照抗原（絲裂原）刺激下2組IFN-γ釋放量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1A。經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激下，結(jié)核組IFN-γ釋放量高于非結(jié)核組（P＜0.01），見圖1B。在結(jié)核組中，呼吸系統(tǒng)結(jié)核與肺外結(jié)核患者IFN-γ釋放量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［4.08（0.58，7.72）IU/mL vs.4.56（0.69，9.93）IU/mL，U=1 250，P＞0.05］；確診結(jié)核組與臨床診斷結(jié)核病組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［4.58（0.78，7.60）IU/mL vs.3.80（0.88，10.00）IU/mL，U=1 122，P＞0.05］。

Fig.1The comparison of the expression quantity of IFN-γ between tuberculosis group and non-tuberculosis group圖1　結(jié)核組與非結(jié)核組患者IFN-γ表達(dá)量的比較

2.3患者IFN-γ釋放量ROC曲線曲線下面積（AUC）為0.913（95%CI：0.864～0.963）。根據(jù)ROC曲線得到的最佳閾值為0.265 IU/mL，此時(shí)QFT-GIT的敏感度為82.86%，特異度為96.33%，見圖2。

Fig.2The ROC curve of IFN-γ release quantity圖2　IFN-γ釋放量ROC曲線

3　討論

3.1臨床檢測結(jié)核病常用指標(biāo)現(xiàn)狀結(jié)核病的早期診斷和治療對結(jié)核病的預(yù)后至關(guān)重要。目前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是細(xì)菌學(xué)檢查，但由于痰涂片抗酸染色的敏感度低、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間長等原因，很難滿足臨床早期診斷的需求。本實(shí)驗(yàn)痰涂片抗酸染色陽性率僅為19.27%（21/109），結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率為28.44%（31/109）。TST所使用的抗原是結(jié)核菌素純蛋白衍生物（PPD），與BCG、非結(jié)核分枝桿菌存在交叉反應(yīng)［5］，使TST的假陽性率增加，診斷特異度降低。

3.2QFT-GIT試驗(yàn)的特點(diǎn)QFT-GIT試驗(yàn)可直接檢測全血中IFN-γ的釋放量，無需分離淋巴細(xì)胞，在臨床應(yīng)用中具有操作簡便、檢測自動化等優(yōu)點(diǎn)。2007年美國食品和藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)QFTGIT試驗(yàn)用于診斷結(jié)核病感染，美國疾病預(yù)防控制中心最新指南中推薦用QFT-GIT代替TST用于結(jié)核病的診斷［6］。QFT-GIT試驗(yàn)使用的抗原是早期分泌靶抗原蛋白-6（ESAT-6）、培養(yǎng)濾液蛋白（CFP-10）以及RD11區(qū)編碼的TB7.7，在BCG和大部分已知的非結(jié)核桿菌中普遍缺失，可避免交叉反應(yīng)［7］，提高檢測的敏感度和特異度，本研究中QFT-GIT試驗(yàn)檢測結(jié)果略高于國外報(bào)道［8-9］。有研究表明在與TB患者接觸的健康人中，有10%的QFT-GIT陽性接觸者和0.4%的QFT-GIT陰性接觸者最終發(fā)展成TB，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），證明QFTGIT試驗(yàn)可作為TB陽性預(yù)測指標(biāo)之一［10］。QFTGIT試驗(yàn)假陰性結(jié)果多見于結(jié)核合并免疫缺陷性疾病，包括腫瘤、慢性病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病、慢性腎功能衰竭以及長期服用免疫抑制劑的患者［11-13］。本研究7例假陰性患者中，4例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和痰涂片抗酸染色陽性，3例僅痰涂片抗酸染色陽性。在7例患者中，4例合并糖尿病，1例合并食管癌，1例合并慢性腎功能不全，但有1例無合并上述疾病，考慮為初次感染，T淋巴細(xì)胞無應(yīng)答狀態(tài)，IFN-γ的分泌量未達(dá)到檢測下限［14］。非結(jié)核組有10例假陽性患者，經(jīng)查證為肺癌、隱球菌感染性肺炎、低鉀血癥患者，其原因需進(jìn)一步探究。

3.3QFT-GIT試驗(yàn)結(jié)果在2組中的差異2組標(biāo)本經(jīng)結(jié)核特異性抗原刺激后IFN-γ釋放量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而經(jīng)陽性對照抗原（絲裂原）刺激后無差異，避免了免疫功能狀態(tài)差異影響QFT-GIT試驗(yàn)結(jié)果的混雜，從而保證結(jié)果的可靠性。IFN-γ釋放量ROC曲線的最佳閾值為0.265 IU/mL，此時(shí)QFTGIT的敏感度為82.86%，特異度為96.33%。因此，QFT-GIT試驗(yàn)診斷結(jié)核病有較高的可靠性。QFTGIT試驗(yàn)診斷結(jié)核病的敏感度、準(zhǔn)確度顯著高于TB-Ab，兩試驗(yàn)聯(lián)合診斷的敏感度降至52.29%，而特異度增加至90.00%。特異度的增加可以有效地降低假陽性率，支氣管擴(kuò)張、肺炎等較結(jié)核病的預(yù)后好，如將其誤診為結(jié)核病，在進(jìn)行抗結(jié)核治療過程中會給患者帶來巨大的傷害。因此，提高結(jié)核病診斷的特異度比敏感度更重要。

3.2QFT-GIT試驗(yàn)的優(yōu)勢QFT-GIT試驗(yàn)雖不能區(qū)分肺內(nèi)結(jié)核病與肺外結(jié)核病，但可以用于結(jié)核病與其他呼吸系統(tǒng)疾病的鑒別診斷，且不受BCG的干擾，具有較高的敏感度和特異度，可用于臨床結(jié)核病的診斷。QFT-GIT試驗(yàn)與國外常用的T-SPOT·TB方法相比，具有操作簡便、快速，技術(shù)要求低，客觀性強(qiáng)，自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，可在醫(yī)院推廣使用，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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（2016-05-10收稿2016-06-20修回）

（本文編輯李鵬）

The diagnosis value of the whole blood interferon-γ release assay in tuberculosis

KONG Haifang1，YUE Na1，LIU Gang2，LI Yanchun1，TIAN Bin1，HU Zhidong1△
1 Department of Laboratory Medicine，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Tianjin Haihe Hospital Laboratory△

E-mail：huzhidong27@163.com

ObjectiveTo evaluate the clinical application of the whole blood interferon γ（IFN-γ）release assay of QuantiFERON TB Gold in tube（QFT-GIT）in diagnosis of tuberculosis.MethodsFrom October 2014 to October 2015，109 patients with tuberculosis（45 cases of confirmed patients and 64 cases of clinically diagnosed patients）and 70 patients with non-tuberculosis were enrolled in Tianjin Medical University General Hospital.In order to evaluate diagnosis value between two kinds of tests，and to compare the differences between two groups，QFT-GIT test and colloidal gold anti tuberculosis antibody（TB-Ab）were employed to detect in two groups of patients.The ROC curve of IFN-γ release quantity was analyzed in two groups.ResultsThe sensitivity and specificity of QFT-GIT were 93.58%and 85.71%respectively. The positive rate was significantly higher in QFT-GIT than that of TB-Ab（χ2=43.68，P＜0.01）.The sensitivity of combined detection of the two methods decreased to 52.3%（57/109），but the specificity increased to 90.0%（63/70）.The release quantity of IFN-γ was significantly higher in tuberculosis group than that in the non-tuberculosis group（U=330，P＜0.05）. The area under the ROC curve of IFN-γ release quantity was 0.913（95%CI:0.864-0.963）.ConclusionThe whole blood IFN-γ release assay of QFT-GIT is a sensitive and specific assay for detecting tuberculosis infection.The combination QFTGIT with TB-Ab can improve the specificity further，which could be a useful tool for the diagnosis of tuberculosis.

tuberculosis；BCG vaccine；diagnostic tests，routine；sensitivity and specificity；ROC curve；interferon-γ release assay；TB-Ab

R446.51，R52

A

10.11958/20160397

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科（郵編300052）；2天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科

孔海芳（1990），女，碩士在讀，主要從事細(xì)菌耐藥方面的研究

E-mail：huzhidong27@163.com